體外誘導(dǎo)成人外周血單個(gè)核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化.pdf

1、目的： 應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子在體外聯(lián)合誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNCs)定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，為外周血干細(xì)胞在組織工程血管化及肢體缺血性疾病的細(xì)胞移植治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法： (1) 無菌條件下，取重組人粒細(xì)胞集落刺激因子刺激后采集的 PBMNCs 2ml，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組1和對照組；健康人外周血20mL，作為實(shí)驗(yàn)組2。肝素抗凝。 (2) Hanks液雙倍

2、稀釋，按1：2置于淋巴細(xì)胞分離液上層，離心后提取分液層與上層交界部位呈混濁的灰白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層。 (3) 取離心后的細(xì)胞，向DMEM-F12培養(yǎng)基中分別加入含體積分?jǐn)?shù)為0.2的胎牛血清、10μg/L血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子、10μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子。對照組中不加血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子等誘導(dǎo)劑。吹打均勻并計(jì)數(shù)，按1×10<'10>L<'-1>接種于25cm<'2>培養(yǎng)瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)

3、為0.05的CO<,2>飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第3天更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，以后每2d換液一次。 (4) 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞單層排列是否呈“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)CD31和vwF情況。透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： (1) 誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化：經(jīng)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)上呈典型的“鋪路石”樣外觀，經(jīng)歷從小圓→梭形→扁平