雷公藤甲素急性腎毒性作用機(jī)制及抗氧化劑維生素C對腎臟的保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景：
　　 雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook．F．TWHf)屬衛(wèi)矛科，其主要活性成分為二萜類化合物雷公藤甲素(triptolide)。許多研究都已證明，雷公藤甲素有多種功效，如免疫抑制、抗炎、抗腫瘤、抗生育作用等。臨床上已經(jīng)利用多種含有雷公藤甲素的雷公藤提取物進(jìn)行相關(guān)疾病的治療，并取得了良好效果。然而，雷公藤甲素卻有著強(qiáng)烈毒性，會對消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)以及骨髓產(chǎn)生毒性作用，造

2、成不同程度的損害，這嚴(yán)重影響了其使用。此外根據(jù)相關(guān)研究，在所有雷公藤甲素中毒致死的案例中，腎功能不全/衰竭是最重要的死亡原因，而且腎臟是雷公藤甲素慢性毒性作用最重要的靶器官。然而到目前為止，尚不清楚雷公藤甲素所致的腎損傷的機(jī)制。因此，從安全角度考慮，必須努力搞清雷公藤甲素腎毒性作用的機(jī)制。
　　 目的：
　　 建立雷公藤甲素致大鼠急性腎損傷模型，研究雷公藤甲素所致大鼠急性腎損傷機(jī)制，并對抗氧化劑維生素C對雷公藤甲素急性腎

3、毒性作用的預(yù)防效果及可能的機(jī)制進(jìn)行研究。具體內(nèi)容包括：
　　 1．建立雷公藤甲素致大鼠急性腎損傷模型；
　　 2．研究氧化應(yīng)激在雷公藤甲素所致大鼠急性腎損傷中的作用；
　　 3．研究細(xì)胞凋亡在雷公藤甲素所致大鼠急性腎損傷中的作用及相關(guān)機(jī)制；
　　 4．研究抗氧化劑維生素C對雷公藤甲素所致大鼠急性腎損傷的預(yù)防作用及可能機(jī)制。
　　 方法：
　　 1．將30只雄性SD大鼠完全隨機(jī)分為1個對照組

4、和2個實驗組，對兩個實驗組大鼠給予腹腔注射劑量分別為1mg/kg和2mg/kg的雷公藤甲素，對照組大鼠則給予相當(dāng)量的空白對照液。注射后48小時將所有大鼠處死，采集心臟血液并取雙側(cè)腎臟固定，檢測血漿尿素氮(PUN)與肌酐(Pcr)含量，HE與Masson病理切片染色觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變情況；測定腎組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性以及ROS、MDA含量。
　　 2．實驗分組、動物處理方法及腎功能檢查同1；應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL

5、)檢測腎組織細(xì)胞凋亡情況；利用免疫組織化學(xué)染色法與Western Blot法檢測腎組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并利用real-time PCR技術(shù)測定腎組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控基因的表達(dá)量。
　　 3．將40只雄性SD大鼠完全隨機(jī)分為4組——(1)對照組：在實驗第8天，給予對照組大鼠腹腔注射(ip)0.9％的生理鹽水；(2)維生素C組：從實驗第1天開始，給予本組大鼠灌服劑量為250mg/kg體重的維生素C溶液（蒸餾水溶解），每天

6、一次，連續(xù)灌服7天，在實驗第8天，給予本組大鼠腹腔注射(ip)0.9％的生理鹽水（操作同對照組）；(3)雷公藤甲素組：在實驗第8天，給予本組大鼠腹腔注射(ip)劑量為1mg/kg體重的雷公藤甲素溶液；(4)維生素C與雷公藤甲素合用組：從實驗第1天開始，給予本組大鼠灌服劑量為250mg/kg體重的維生素C溶液（蒸餾水溶解），每天一次，連續(xù)灌服7天，在實驗第8天，給予本組大鼠腹腔注射(ip)劑量為1mg/kg體重的雷公藤甲素溶液（操作同雷公

7、藤甲素組）。在實驗第10天，將所有大鼠處死，抽取心臟血液并取雙側(cè)腎臟。測定腎組織內(nèi)SOD、GSH-Px活性以及ROS、MDA含量；檢測血漿尿素氮(PUN)與肌酐(Pcr)含量；觀察HE與TUNEL染色切片上腎組織形態(tài)學(xué)與細(xì)胞凋亡情況；Western Blot法檢測腎組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，并利用real-time PCR技術(shù)測定腎組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白調(diào)控基因的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：
　　 1．一次性大劑量注射雷公藤甲

8、素可在短時間內(nèi)對大鼠腎臟造成嚴(yán)重?fù)p傷，劑量越大越顯著；經(jīng)雷公藤甲素處理后，腎組織中SOD與GSH-Px活性明顯降低，而ROS與MDA含量則明顯升高，且均與腎臟的損傷程度密切相關(guān)。
　　 2．兩個雷公藤甲素處理組均可見大量腎小管上皮細(xì)胞凋亡，劑量越大越顯著，且與腎功能改變相關(guān)；經(jīng)雷公藤甲素處理后，腎組織中Bax、Bid、Bad、Fas以及FasL表達(dá)明顯增多，且呈劑量依賴性改變；盡管Bcl-2的表達(dá)未見明顯改變，但Bax/Bcl-

9、2表達(dá)量比值卻呈劑量依賴性升高。
　　 3．維生素C預(yù)處理大鼠腎組織中抗氧化酶活性比單純使用雷公藤甲素注射大鼠顯著提高，而ROS與MDA含量則明顯下降；與單純注射雷公藤甲素大鼠相比，維生素C預(yù)處理大鼠腎功能顯著改善；維生素C預(yù)處理大鼠腎臟結(jié)構(gòu)損傷程度比單純注射雷公藤甲素大鼠顯著減輕，腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少；與雷公藤甲素組相比，維生素C與雷公藤甲素合用組大鼠腎臟中Bax、Bid、Bad表達(dá)量以及Bax/Bcl-2表達(dá)量比值

10、顯著下降，而Fas/FasL表達(dá)情況則沒有顯著差異。
　　 結(jié)論：
　　 1．腎臟是雷公藤甲素急性毒性作用重要的靶器官，氧化應(yīng)激損傷在雷公藤甲素對腎臟造成的毒性損害中發(fā)揮了重要作用。
　　 2．腎小管上皮細(xì)胞凋亡是雷公藤甲素所致大鼠急性腎損傷時重要的組織學(xué)基礎(chǔ)之一，且Bcl-2家族以及Fas/FasL在雷公藤甲素誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡的過程中起到了重要作用。
　　 3．維生素C能夠顯著抑制雷公藤甲素對大