鎳化合物誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的分子機(jī)理的研究.pdf

1、鎳是人類(lèi)在職業(yè)和環(huán)境中廣泛接觸的一種金屬元素，是動(dòng)物必需微量元素之一。人群流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)鎳的職業(yè)性接觸可以引起癌癥，主要是肺癌，國(guó)際癌癥研究中心(IARC)1990年將鎳及其化合物列為第一類(lèi)致癌物。其中尤以鎳塵Ni3S2致癌性最強(qiáng)，其次為Ni2O3。近年來(lái)，含鎳產(chǎn)品的廣泛使用使得鎳在其生產(chǎn)、再利用以及處理的各個(gè)階段都會(huì)不可避免地導(dǎo)致環(huán)境的污染。人類(lèi)在工作和生活中與之廣泛接觸，使得大量鎳和鎳的化合物通過(guò)職業(yè)和環(huán)境接觸沉積于

2、體內(nèi)，并對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生不利影響。目前有關(guān)鎳致癌機(jī)理的研究，主要集中在四個(gè)方面：一是鎳誘導(dǎo)突變的形成，繼而導(dǎo)致癌相關(guān)基因表達(dá)異常，誘發(fā)腫瘤的形成，例如利用鎳誘導(dǎo)肺癌發(fā)生時(shí)P53基因出現(xiàn)堿基G→T的轉(zhuǎn)換，但可以肯定的是鎳是一種低誘突變劑。二是鎳誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的損傷，例如DNA損傷或染色體斷裂，影響癌相關(guān)基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。三是鎳誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變，如鎳可誘導(dǎo)3T3細(xì)胞中NFκB的表達(dá)，繼而導(dǎo)致

3、腫瘤的形成。四是除了鎳直接誘導(dǎo)基因組的改變，影響基因表達(dá)之外，人們發(fā)現(xiàn)鎳可以通過(guò)表觀(guān)遺傳學(xué)的改變，繼而影響癌相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。目前有關(guān)鎳誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生以及急性肺損傷的研究很多，也提出了許多有關(guān)鎳誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的假說(shuō)，但是由于鎳在人體中代謝的復(fù)雜性，有關(guān)鎳導(dǎo)致肺癌的機(jī)制并未完全明了，因此本論文將從鎳化合物誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、影響抗氧化系統(tǒng)及相關(guān)酶類(lèi)的基因表達(dá)以及表觀(guān)遺傳學(xué)改變等三個(gè)方面對(duì)鎳的致癌機(jī)制進(jìn)行初步的研究，試圖為職業(yè)性肺癌的化

4、學(xué)預(yù)防和治療提供一些理論依據(jù)。 方法:Ⅰ體外運(yùn)用不同濃度的Ni2O3(0.5～2.0mg/L)多次處理人胚肺成纖維細(xì)胞(HLF)，利用刀豆凝集素A(ConA)凝集試驗(yàn)和軟瓊脂集落形成試驗(yàn)進(jìn)行轉(zhuǎn)化細(xì)胞的惡性鑒定。使用不同濃度的硫化鎳(Ni3S2)、氧化鎳(Ni2O3)和硫酸鎳(NiSO4)處理HLF細(xì)胞，通過(guò)單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(singlecellgelelectrophoresis，SCGE)檢測(cè)細(xì)胞DNA損傷程度。Ⅱ體外用Ni

5、2O3(5μg/ml)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞(alveolarmacrophage，AM)，觀(guān)察細(xì)胞存活率及活力，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和活性氧(ROS)的產(chǎn)生；觀(guān)察超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，iNOS)活力的變化，以及應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定iNOSmRNA的表達(dá)。同時(shí)用Ni2O3(5μg/ml、10μ

6、g/ml和15μg/ml)處理人胚肺成纖維細(xì)胞(WI-38)，通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)氧化損傷相關(guān)基因硫氧還蛋白(TRX)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)改變，用realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)血紅素氧合酶(HO-1)的表達(dá)改變。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)將SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分為正常對(duì)照組、Ni3S2處理組和Ni2O3處理組。分別在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)、3個(gè)月和6個(gè)月，在大鼠左后腿三頭肌分別注射0.2ml氯霉素

7、溶液、含10mgNi3S2或10mgNi2O3氯霉素懸液0.2ml(Ni3S2和Ni2O3配制前經(jīng)高溫消毒)，16月后，測(cè)定其血清、心、肝中SOD、GSH-Px、NOS、NO、MDA等指標(biāo)。同時(shí)收集各組動(dòng)物的肺泡巨噬細(xì)胞，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)，測(cè)定細(xì)胞的周期分布、胞內(nèi)鈣離子濃度和線(xiàn)粒體膜電位。Ⅲ采用甲基化特異性PCR(methylation-specific-PCR，MSP)方法，檢測(cè)經(jīng)過(guò)鎳化合物處理的WI-38細(xì)胞和大鼠肺癌組織中

8、與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)的P16、RAS相關(guān)區(qū)域家族1(RASSF1)基因，以及與DNA修復(fù)有關(guān)的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)和死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK1)基因5'啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化情況。 結(jié)果: ⅠNi2O3可誘導(dǎo)HLF惡性轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)速度加快，排列紊亂，失去接觸抑制，呈交叉重疊生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可被低濃度ConA凝集，并在軟瓊脂內(nèi)生長(zhǎng)。SCGE檢測(cè)結(jié)果顯示：不同濃度的Ni

9、3S2、Ni2O3和NiSO4處理HLF細(xì)胞較正常對(duì)照組細(xì)胞DNA損傷程度增高(P＜0.01)。正常對(duì)照組彗星尾矩為10.06±0.32(μm)；Ni3S2組(2.5μg/ml，5μg/ml和10μg/ml)尾矩分別為65.50±0.44(μm)，114.08±1.08(μm)和189.23±0.62(μm)；Ni2O3組(2.5μg/ml，5μg/ml和10μg/ml)尾矩分別為75.86±1.86(μm)，87.89±2.07(μm

10、)和133.09±1.17(μm)；NiSO4組(155μg/ml，309μg/ml和464μg/ml)尾矩分別為62.20±0.42(μm)，111.40±1.73(μm)和412.49±2.46(μm)。鎳處理各組尾矩均較對(duì)照組增大(P＜0.01)。 Ⅱ體外實(shí)驗(yàn)中，染鎳大鼠肺泡巨噬細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞的存活率和活力下降，MDA、NO和ROS的產(chǎn)生增加，NOS的活性增高，SOD、GSH-Px和CAT的活性下降，iNOSmRNA表達(dá)增

11、高。Ni2O3處理組的WI-38細(xì)胞VEGF、HO-1基因較對(duì)照組表達(dá)上升而TRX下降。5μg/ml和10μg/mlNi2O3組在作用48h后，HIF-1表達(dá)顯著高于對(duì)照組，72h后開(kāi)始下降；15μg/mlNi2O3組在48h時(shí)較對(duì)照組下降，72h后下降更為顯著。染鎳大鼠血清SOD，心肌SOD、GSH-Px較對(duì)照組下降。MDA、NOS和NO在血清、心、肝中均升高。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：Ni3S2組大鼠肺泡巨噬細(xì)胞較對(duì)照組的凋亡率明顯增加，

12、線(xiàn)粒體膜電位變小，胞內(nèi)游離鈣濃度有增加的趨勢(shì)。Ni2O3組較對(duì)照組的凋亡率和胞內(nèi)游離鈣濃度均有增加的趨勢(shì)，線(xiàn)粒體膜電位有下降的趨勢(shì)。 ⅢMSP結(jié)果顯示：在正常WI-38細(xì)胞中P16和RASSF1基因沒(méi)有甲基化，而在鎳化合物轉(zhuǎn)化處理的細(xì)胞中P16甲基化率為27.8％，RASSF1為44.4％。在2例鎳誘導(dǎo)的大鼠肺癌組織中P16、RASSF1、MGMT和DAPK1基因均發(fā)生甲基化；正常肺組織沒(méi)有甲基化。 結(jié)論: ⅠN

13、i2O3有較強(qiáng)的誘導(dǎo)HLF細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力，三種鎳化合物均可引起細(xì)胞DNA損傷，具有致癌性。 Ⅱ鎳可致細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化、導(dǎo)致機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的損傷是鎳致癌的機(jī)制之一。TRX、HIF-1、VEGF和HO-1等與氧化損傷相關(guān)基因表達(dá)的改變?cè)阪囌T導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中起重要的作用。線(xiàn)粒體膜電位下降，胞內(nèi)外Ca2+濃度的改變可能是造成染鎳大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡的原因。肺泡巨噬細(xì)胞凋亡使得肺部防御病原微生物和肺損傷以及抗原提呈能力下降，有利于腫瘤的