小分子化合物誘導人肺腺癌A549細胞凋亡機理研究.pdf

1、研究目的: 近年來，肺癌死亡率居于各種惡性腫瘤之首位，其中肺腺癌最常見并且其發(fā)病率最高。由于腫瘤發(fā)生和生長的主要原因在于細胞凋亡受到抑制，因此，誘導肺腺癌細胞凋亡是治療肺腺癌的重要措施，也是降低肺癌死亡率的有力手段之一。本文以人肺腺癌A549細胞系為例，利用化學遺傳學這一新興技術平臺，篩選有效的誘導肺腺癌細胞凋亡的小分子化合物并研究其凋亡誘導分子機制，為進一步研究小分子凋亡誘導劑的特異性靶蛋白這一后續(xù)工作奠定基礎，同時為開發(fā)新型

2、的肺腺癌治療藥物提供理論依據(jù)。 研究內容: 1．對小分子化合物進行初步篩選 2．鑒定小分子化合物對A549細胞的凋亡誘導作用 3．研究小分子化合物誘導A549細胞凋亡的分子機制 研究方法: 1．MTT法檢測細胞存活率，由此對小分子化合物進行初步篩選 2．倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化 3．LDH(乳酸脫氫酶)檢測細胞是否出現(xiàn)壞死 4．吖啶橙染色結合激光掃描共聚焦顯微

3、鏡觀察，檢測細胞核凝集 5．TUNEL染色檢測DNA片段化和凋亡率 6．熒光探針DCHF檢測ROS表達水平 7．利用TMRM染色檢測細胞線粒體膜電位變化[Falchietal，2005] 8．免疫熒光化學法檢測膜整連蛋白β4的表達 研究結果: 1. 苯并噁嗪酮衍生物對A549細胞的生長抑制作用 1.1 MTT檢測結果表明，在24h-48h內，5種苯并噁嗪酮衍生物(1-5＃)均能抑制

4、A549細胞的生長，且其抑制作用呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。 1.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：200μM苯并噁嗪酮衍生物(1-5＃)分別處理A549細胞24h，細胞明顯縮小，有的細胞變圓。 2. 二茂鐵基吡唑并哌嗪化合物對A549細胞的凋亡誘導作用 2.1 MTT檢測結果表明，在24h-48h內，6種二茂鐵基吡唑并哌嗪化合物(8a-8f)均能顯著降低A549細胞的存活率并且其作用效果呈現(xiàn)時間和濃度依賴性。

5、 2.2 倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)：8d-8f各20μM分別處理A549細胞24h-48 h，細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學特征。 2.3 吖啶橙染色結合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測細胞核片段化，發(fā)現(xiàn)：20μM8d-8f分別處理A549細胞48h時，細胞核固縮、染色質凝集、凋亡小體清晰可見。 2.4 LDH檢測發(fā)現(xiàn)：8d-8f各20μM分別處理A549細胞48h時，與對照組細胞相比，培養(yǎng)液中LDH酶活濃度未發(fā)生顯著性變化(

6、P>0.05)。 2.5 TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，8d-8f各20μM分別處理A549細胞48h，TUNEL染色陽性率顯著升高(P<0.01)。 2.6 使用熒光探針DCHF檢測細胞內ROS水平的變化，結果發(fā)現(xiàn)，8d-8f各20μM分別處理A549細胞48h時，細胞內的ROS水平顯著升高(p<0.01)。 2.7 利用TMRM染色檢測細胞線粒體膜電位的變化，結果顯示，8d-8f各20μM分別處理A549細胞48h時，

7、細胞內的線粒體膜電位顯著升高(P<0.01)。 2.8 免疫細胞化學檢測發(fā)現(xiàn)，8d-8f各20μM分別處理A549細胞48h時，膜整連蛋白β4的水平顯著升高(p<0.01)。 結論: 1．小分子化合物初步篩選結果表明，5種苯并噁嗪酮衍生物對A549細胞生長均有抑制作用，其中2＃、3＃和5?；衔锏囊种谱饔帽容^明顯。 2．MTT初步篩選結果顯示，6種二茂鐵基吡唑并哌嗪化合物(8a-8f)對A549細胞增殖均

8、有抑制作用，但其增殖抑制能力不同，其中8d、8e、8f三種小分子化合物增殖抑制能力較強，因此選取該三種小分子繼續(xù)研究其對A549細胞的作用及其分子機制。 3．8d、8e、8f三種小分子化合物20μM均能誘導A549細胞凋亡，而該凋亡誘導作用可能是通過提高ROS水平和影響線粒體膜電位來實現(xiàn)的。 4．在8d、8e、8f三種小分子化合物誘導A549細胞凋亡的過程中，膜整連蛋白β4的表達水平升高，說明膜整連蛋白β4可能是該類小分