P38MAPK信號通路在卵巢上皮性癌順鉑耐藥中的作用機制及逆轉(zhuǎn)策略.pdf

1、目的：卵巢癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一,死亡率居婦科惡性腫瘤的首位,成為婦科惡性腫瘤威脅最大的疾病。近年來新輔助化療即先期化療(neoadjuvantchemotherapy,NACT)成為一種新的治療手段,探索先期化療在卵巢癌化療耐藥中的作用意義重大,部分卵巢上皮性癌患者對以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案原發(fā)耐藥或繼發(fā)性鉑類耐藥,可直接影響化療效果及患者預(yù)后。
　　 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated prote

2、in kinases,MAPK)是哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,與細胞增殖和凋亡密切相關(guān)。研究表明,P38MAPK受抑制是順鉑耐藥的原因,但具體機制尚需探討。
　　 丹參酮ⅡA(TanⅡA)為中藥丹參的提取物,近年研究表明,丹參酮ⅡA對多種腫瘤細胞具有細胞毒性作用,并可誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡,抑制腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,其機制可能與抑制DNA合成、調(diào)節(jié)細胞周期、影響凋亡和原癌基因的表達等有關(guān)。TanⅡA的抗腫瘤作用

3、目前在白血病、肝癌、胃癌等臨床治療中已有應(yīng)用,且表現(xiàn)出較好的療效。有研究表明TanⅡA的抗腫瘤作用是通過P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的。但對于TanⅡA通過P38 MAPK逆轉(zhuǎn)卵巢上皮性癌順鉑耐藥的研究尚未見報道。
　　 本實驗研究P38MAPK通路在不同化療療程上皮性卵巢癌中的表達及其與凋亡抑制蛋白Survivin、耐藥相關(guān)蛋白(切除修復(fù)交叉互補基因1(ERCC1),肺耐藥相關(guān)蛋白(LRP),谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST-π))表

4、達的相關(guān)性及與預(yù)后的關(guān)系,并探討丹參酮ⅡA通過激活P38MAPK通路,在逆轉(zhuǎn)卵巢上皮性癌順鉑化療耐藥中的作用。
　　 方法：
　　 1、通過免疫組化實驗,檢測正常卵巢組織10例,原發(fā)性卵巢上皮癌29例,經(jīng)新輔助化療后行手術(shù)的卵巢上皮性癌患者自身配對標本17對,復(fù)發(fā)性卵巢上皮癌患者30例中p-P38,Survivin及耐藥蛋白ERCC1,LRP,GST的變化及其相關(guān)性,并進行隨訪。
　　 2、采用順鉑不同時間、不同

5、濃度作用于上皮性卵巢癌COC1及順鉑耐藥細胞COC1/DDP細胞,Western blot方法檢測P38MAPK磷酸化水平的變化。
　　 3、MTT法檢測順鉑耐藥細胞COC1/DDP細胞的順鉑耐藥指數(shù),并檢測P38MAPK抑制劑SB203580處理后COC1/DDP細胞的順鉑耐藥指數(shù)的變化。
　　 4、采用P38shRNA技術(shù)對COC1的P38基因進行干擾后檢測其耐藥指數(shù)與COC1/DDP細胞的順鉑耐藥指數(shù)進行比較。

6、r>　　 5、采用實時定量PCR技術(shù)檢測COC1、COC1/DDP細胞中、用SB203580處理細胞后及P38shRNA干擾COC1細胞后,耐藥蛋白ERCC1、MDR、LRP、GST-π及凋亡蛋白Caspase3、Survivin等mRNA的表達變化。
　　 6、采用MTT的方法繪制不同劑量TanⅡA對COC1/DDP生長曲線的影響,選取合適濃度及作用時間的TanⅡA作用于COC1/DDP后檢測其順鉑耐藥指數(shù)的變化。
　

7、　 7、采用流式細胞術(shù)檢測不同劑量TanⅡA作用不同時間后對COC1/DDP凋亡的影響,并檢測TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其聯(lián)合用藥后對COC1/DDP凋亡的影響。
　　 8、采用Western blot方法檢測不同劑量TanⅡA作用不同時間后對COC1/DDP細胞中P38及p-P38蛋白表達水平的影響,并檢測TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其聯(lián)合用藥后對COC1/DDP細胞中P38及P

8、-P38蛋白表達水平的影響。
　　 9、采用實時定量PCR的方法檢測TanⅡA、Cisplatin、SB203580及其聯(lián)合用藥后對COC1/DDP細胞中耐藥蛋白ERCC1、MDR、LRP、GST-π及凋亡蛋白Caspase3、Survivin等mRNA表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、p-P38在原發(fā)性卵巢癌患者中的表達與新輔助化療術(shù)后患者中的陽性表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),但明顯高于復(fù)發(fā)性卵巢癌

9、組(P＜0.01);Survivin、ERCC1、GST-π在原發(fā)性卵巢癌患者中的表達與新輔助化療術(shù)后患者中的陽性表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),但明顯低于復(fù)發(fā)性卵巢癌組(P＜0.01)。
　　 2、新輔助化療前后的自身配對標本中p-P38、Survivin、ERCCl、LRP、GST-π蛋白的表達情況均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3、p-P38與Survivin、ERCC1、LRP之間存在負相關(guān)性(p＜

10、0.01),但與GST-π之間無相關(guān)性(P＞0.05)。
　　 4、p-P38陰性組平均生存時間短于陽性組平均生存時間,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.006)。
　　 5、在一定時間濃度梯度下,順鉑可誘導(dǎo)卵巢癌順鉑敏感株COC1及耐藥株COC1/DDP細胞內(nèi)P38MAPK的激活,但耐藥株的激活程度弱于敏感株。
　　 6、P38MAPK抑制劑SB203580及P38shRNA干擾可增加卵巢癌細胞株的耐藥指數(shù)。

11、>　　 7、應(yīng)用SB203580及P38shRNA干擾后SurvivinmRNA、ERCC1mRNA及LRPmRNA的表達明顯上調(diào)。
　　 8、TanⅡA(8μg/ml)明顯降低了COC1/DDP細胞對順鉑的耐藥指數(shù)(2.35±0.22),兩者比較差異顯著(p＜0.01)。
　　 9、TanⅡA可誘導(dǎo)COC1/DDP細胞凋亡,呈時間及濃度依賴性。
　　 10、TanⅡA(8μg/ml)與順鉑(20μM)聯(lián)合作用

12、于COC1/DDP細胞后,細胞凋亡率顯著高于順鉑單獨作用時(p＜0.01)。P38 MAPK抑制劑SB203580(10μM)可顯著抑制TanⅡA引起的細胞凋亡率的升高(p＜0.01)。
　　 11、隨TanⅡA作用時間的增加,p-P38蛋白的表達逐漸增強(p＜0.01)。隨TanⅡA作用濃度的增加,p-P38蛋白的表達也逐漸增強(p＜0.01)。
　　 12、TanⅡA(8μg/ml)與順鉑(20μM)聯(lián)合作用于COC

13、1/DDP細胞后,p-P38蛋白的表達明顯強于單獨用藥時(p＜0.01)。
　　 13、TanⅡA(80μg/ml)作用于COC1/DDP細胞48h后,與空白對照組相比Survivin(p＜0.05),ERCC1(p＜0.01),LRP(p＜0.01)及GST-π(p＜0.01)的mRNA表達均顯著下調(diào),但Caspase3及MDR無明顯變化。SB203580(10μM)可顯著上調(diào)Survivin,ERCC1及LRP的mRNA的表

14、達(p＜0.01),并可顯著上調(diào)TanⅡA引起的Survivin,ERCC1及LRP的mRNA表達下調(diào)(p＜0.01)。TanⅡA(8μg/ml)還可以減弱順鉑引起的Survivin(p＜0.05)及LRP(p＜0.01)mRNA的表達上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1、多療程化療可能通過抑制P38MAPK通路而提高Survivin、ERCC1、LRP的表達導(dǎo)致上皮性卵巢癌鉑類耐藥的產(chǎn)生,而新輔助化療并不能導(dǎo)致術(shù)后耐藥機會的

15、增加。
　　 2、P38MAPK通路的激活可能改善鉑類耐藥患者的預(yù)后。
　　 3、P38MAPK受抑制可能導(dǎo)致卵巢上皮性癌順鉑耐藥的產(chǎn)生,其機制可能是通過上調(diào)了Survivin、ERCC1及LRP的mRNA表達實現(xiàn)的。
　　 4、TanⅡA能夠顯著增強卵巢癌順鉑耐藥細胞對順鉑的敏感性。
　　 5、TanⅡA通過激活P38MAPK下調(diào)了抗凋亡蛋白Survivin,從而誘發(fā)了卵巢癌順鉑耐藥細胞的凋亡。