家蠶免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子BmFAF的功能與作用機(jī)制研究.pdf

1、家蠶先天免疫反應(yīng)主要包括體液免疫、細(xì)胞免疫和黑化反應(yīng)。體液免疫表現(xiàn)為產(chǎn)生抗菌肽抵御微生物入侵，這需要通過Toll或Imd信號通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Dorsal/Dif或Relish的激活來實(shí)現(xiàn)。但正常情況下，這種免疫應(yīng)答通路的激活會受到體內(nèi)相應(yīng)的負(fù)調(diào)控機(jī)制調(diào)控，從而抑制免疫系統(tǒng)過度激活，保持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。對雙翅目昆蟲的模式生物果蠅的相關(guān)研究表明，通過突變、敲除或轉(zhuǎn)基因干涉等手段，已發(fā)現(xiàn)了多種使免疫系統(tǒng)核轉(zhuǎn)錄因子活性降低或阻止其入核的免疫穩(wěn)態(tài)

2、調(diào)控分子。在鱗翅目昆蟲中，該項(xiàng)研究仍是空白。因此，對其模式生物家蠶在免疫穩(wěn)態(tài)方面的研究就成為免疫系統(tǒng)的研究重點(diǎn)。
　　本研究針對已篩選到的可能的免疫穩(wěn)態(tài)分子BmFAF進(jìn)行了特征分析、功能鑒定、作用機(jī)制研究和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域分析。通過多序列比對、時(shí)空表達(dá)譜和免疫誘導(dǎo)表達(dá)譜構(gòu)建，確定其免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子特征;通過在細(xì)胞和個(gè)體水平干涉或過表達(dá)BmFAF等生物學(xué)技術(shù)，對其負(fù)調(diào)控特征進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;通過免疫沉淀、GST-pull down、West

3、ern Blotting和酶活檢測等手段探究了其發(fā)揮功能的作用機(jī)制和關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。主要研究結(jié)果如下:
　　1、BmFAF是家蠶免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子
　　基于家蠶數(shù)據(jù)庫中通過多序列比對篩選到的免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控分子，重點(diǎn)對編號為BGIBMGA008874的BmFAF進(jìn)行了特征分析和功能鑒定。BmFAF在家蠶免疫組織中腸和脂肪體中表達(dá)量較低，在眠蠶期表達(dá)量總是顯著高于起蠶期;家蠶受微生物感染0.5 h后，BmFAF即顯著下調(diào)表達(dá)，相應(yīng)抗菌肽

4、CecropinA1則上調(diào)表達(dá)，表明該分子具有免疫負(fù)調(diào)控分子的特征;細(xì)胞水平過表達(dá)BmFAF，抗菌肽Attacin、Moricin、CecropinA1顯著下調(diào)，細(xì)胞水平有效干涉BmFAF，抗菌肽Moricin、CecropinA1顯著上調(diào);個(gè)體水平干涉BmFAF，抗菌肽Attacin、Moricin、CecropinA1顯著上調(diào)，且個(gè)體存活率顯著升高。細(xì)胞和個(gè)體水平的干涉和過表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明該分子負(fù)調(diào)控抗菌肽的表達(dá)。
　　2、

5、BmFAF通過相互作用促進(jìn)Relishact泛素化降解負(fù)調(diào)控IMD信號通路
　　通過Western blotting、相對熒光素酶活性檢測等手段在家蠶細(xì)胞水平驗(yàn)證Dredd能夠切割Relish-FL使其成為成熟體Relishact，從而上調(diào)下游的抗菌肽表達(dá)，而BmFAF的存在使得這種上調(diào)效果減弱。進(jìn)一步研究表明，BmFAF通過抑制Relishact的活性抑制NF-κB通路，在蛋白水平而非mRNA水平促進(jìn)Relishact通過泛素化

6、蛋白酶體途徑降解，從而降低抗菌肽的表達(dá)。通過GST pull down和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明，BmFAF具有自泛素化現(xiàn)象，能夠結(jié)合泛素化的蛋白，通過物理性相互作用促使Relishact泛素化降解從而抑制其活性。
　　3、UBA結(jié)構(gòu)域是BmFAF發(fā)揮負(fù)調(diào)控功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域
　　構(gòu)建BmFAF的5個(gè)截短突變基因片段的真核表達(dá)載體，通過Westem blotting、相對熒光素酶活性檢測等手段證明BmFAF通過其UBA結(jié)構(gòu)域抑制Rel