BmFoxO基因調(diào)控家蠶壽命的分子機(jī)制研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要基礎(chǔ)和強(qiáng)力支撐。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被應(yīng)用到生命科學(xué)研究中。長(zhǎng)久以來(lái)，益壽延年一直是人類追求的夢(mèng)想，因此，衰老和壽命決定機(jī)制研究一直是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　目前應(yīng)用于壽命研究的無(wú)脊椎動(dòng)物模型主要包括秀麗隱桿線蟲(chóng)和黑腹果蠅，脊椎動(dòng)物模型主要包括小鼠和猴子。由于衰老和壽命調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性，模式生物在該領(lǐng)域研究中的利用至關(guān)重要。其中，身體構(gòu)造簡(jiǎn)單而器官分化卻相對(duì)完整的無(wú)脊椎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受

2、到廣大研究者的青睞。至今，少數(shù)的無(wú)脊椎動(dòng)物模型并不能完全滿足復(fù)雜的壽命機(jī)制研究的需要，新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的開(kāi)發(fā)利用十分必要。
　　數(shù)千年的馴養(yǎng)和蠶業(yè)發(fā)展賦予了家蠶獨(dú)特的生物學(xué)特點(diǎn)及文化內(nèi)涵。長(zhǎng)達(dá)一個(gè)世紀(jì)收集和研究積淀了豐富的突變資源，以及率先開(kāi)展了基因組和功能基因組研究，為家蠶的拓展利用提供了良好的基礎(chǔ)。同時(shí)，家蠶也具備諸多作為壽命研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的特征，如生命周期和個(gè)體大小適中、繁殖力強(qiáng)、發(fā)育階段界限清晰、外源注射所導(dǎo)致的物理?yè)p傷較小、

3、壽命可塑性較強(qiáng)及不存在倫理問(wèn)題等。有鑒于此，本研究選擇家蠶作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，鑒定重要壽命基因及分析基因調(diào)控家蠶壽命的機(jī)制，為壽命決定分子機(jī)制的闡釋提供新的認(rèn)知。主要獲得了如下研究結(jié)果：
　　1.家蠶壽命與BmFoxO基因表達(dá)量間的關(guān)系
　　家蠶各品系的發(fā)育時(shí)長(zhǎng)不同，壽命也存在差異。從家蠶基因庫(kù)中選取一組品系進(jìn)行壽命統(tǒng)計(jì)，并對(duì)其中的三個(gè)代表性品系（夏芳、Dazao-N、N4）進(jìn)行壽命相關(guān)基因表達(dá)模式的調(diào)查，結(jié)果顯示：夏芳的平均壽命

4、和最大壽命均較長(zhǎng)，Dazao-N次之，N4品系的平均壽命和最大壽命較短。鑒于FoxO在多個(gè)物種中被報(bào)道是調(diào)控壽命的關(guān)鍵因子，我們調(diào)查了這些品系中BmFoxO在不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在蛹10天（可能決定成蟲(chóng)壽命的時(shí)間點(diǎn)），BmFoxO的表達(dá)量為夏芳顯著高于Dazao-N和N4，并且N4顯著低于Dazao-N。同時(shí)，在被調(diào)查的其他發(fā)育時(shí)期，BmFoxO表達(dá)趨勢(shì)與相應(yīng)品系的壽命也呈現(xiàn)出高度一致。通過(guò)控制家蠶飲食攝入量，成功構(gòu)建了家蠶飲食

5、限制實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?；壽命統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明飲食限制組壽命明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，并且BmFoxO表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。鑒于BmFoxO的表達(dá)與壽命顯著相關(guān)，所以推測(cè)該基因發(fā)揮了調(diào)控家蠶壽命的功能。
　　2.家蠶Fox基因家族的鑒定與進(jìn)化分析
　　Fox基因編碼的是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，包含23個(gè)亞家族（FoxA-FoxS）。在家蠶中利用隱馬爾可夫模型對(duì)Fox基因家族成員進(jìn)行全基因組的分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)家蠶中含有17個(gè)Fox家族成員。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)生分析

6、，將這17個(gè)Fox家族基因歸類于13個(gè)Fox亞家族。對(duì)其所屬的染色體位置進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)這些成員分布于13條不同的染色體上。利用相同的隱馬爾可夫模型識(shí)別紅帶袖蝶、帝王蝶、果蠅、小鼠和人類中的Fox基因家族成員，并利用這些序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，結(jié)果表明不同物種中的直系同源基因間序列高度保守。同時(shí)，對(duì)家蠶中 Fox家族基因的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特征分析，表明家蠶中 Fox基因大多屬于單外顯子基因，蛋白均包含有保守的Fork head結(jié)構(gòu)域。家蠶中F

7、ox家族基因的GO注釋表明，其編碼產(chǎn)物除未參與核孔復(fù)合體的生物合成過(guò)程外，參與了生物體內(nèi)的諸多其他生物學(xué)過(guò)程。對(duì)家蠶中的Fox家族成員進(jìn)行選擇壓力分析，結(jié)果表明Fox家族蛋白的結(jié)構(gòu)域受到強(qiáng)烈的純化選擇。在系統(tǒng)發(fā)生分析中，依據(jù)參考序列對(duì)家蠶Fox基因家族中的每個(gè)成員進(jìn)行了命名；同時(shí)發(fā)現(xiàn)FoxK亞家族在家蠶中特異性缺失。
　　3.BmFoxO在調(diào)控壽命中的功能探究
　　為了探索BmFoxO基因在壽命調(diào)控過(guò)程中的作用，進(jìn)行了BmF

8、oxO的干涉實(shí)驗(yàn)。鑒于BmFoxO在家蠶羽化1天的血淋巴中表達(dá)量較高，選擇此時(shí)期的血淋巴作為BmFoxO干涉的組織，設(shè)計(jì)并合成特異的BmFoxO雙鏈RNA干涉片段（BmFoxO-dsRNA）。由于雙鏈干涉發(fā)揮效應(yīng)需要一定時(shí)間，利用家蠶外源注射技術(shù)將BmFoxO-dsRNA通過(guò)家蠶氣孔注入家蠶蛹10天的血淋巴中。結(jié)果表明，BmFoxO-dsRNA能夠顯著降低BmFoxO的表達(dá)水平，進(jìn)而顯著縮短家蠶成蟲(chóng)期的壽命。為了探測(cè) BmFoxO的過(guò)表

9、達(dá)能否延長(zhǎng)家蠶成蟲(chóng)期壽命，構(gòu)建了piggyBac-IE1-BmFoxO-SV40過(guò)表達(dá)載體并將其導(dǎo)入蛹10天家蠶血淋巴中，BmFoxO的表達(dá)水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其在注射后42h被顯著上調(diào)。壽命統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)BmFoxO能夠顯著延長(zhǎng)家蠶成蟲(chóng)期的平均壽命和最大壽命。利用Crispr-Cas9技術(shù)對(duì)BmFoxO進(jìn)行敲除，分子檢測(cè)表明G1代家蠶中BmFoxO的基因組序列確實(shí)發(fā)生了編輯。后續(xù)研究需要確定其能否對(duì)G2代家蠶的壽命產(chǎn)生影響

10、。
　　4.BmFoxO的靶基因篩選及其對(duì)壽命的影響
　　BmFoxO表達(dá)水平的升高能夠顯著延長(zhǎng)家蠶個(gè)體壽命已經(jīng)得到了證實(shí)，然而其延長(zhǎng)壽命的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。由于BmFoxO屬于轉(zhuǎn)錄因子，其在執(zhí)行功能過(guò)程中需要通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此FoxO下游靶基因的篩查和鑒定將為FoxO調(diào)控壽命的機(jī)制解析提供清晰的方向。構(gòu)建BmFoxO組成型過(guò)表達(dá)和干涉載體，轉(zhuǎn)染家蠶BmN-SWU1細(xì)胞，經(jīng)抗生素篩選后，獲得了較

11、為穩(wěn)定的BmFoxO組成型過(guò)表達(dá)和干涉的細(xì)胞系。免疫熒光和western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BmFoxO組成型過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染后表達(dá)的蛋白位于細(xì)胞核中，能夠發(fā)揮調(diào)控靶基因的功能。定量檢測(cè)確認(rèn)組成型過(guò)表達(dá)和干涉細(xì)胞系中BmFoxO的表達(dá)水平，相比于對(duì)照組確實(shí)被上調(diào)和下調(diào)。就BmFoxO組成型過(guò)表達(dá)和干涉的細(xì)胞系取材提取RNA，進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序。結(jié)合本小組唐冬梅對(duì)表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果的分析所發(fā)現(xiàn)的符合正調(diào)控或負(fù)調(diào)控的差異表達(dá)基因共212個(gè)；我們結(jié)合果蠅Fo

12、xO靶基因的對(duì)比分析和多層篩選，最終選出家蠶和果蠅靶基因中共有的基因2個(gè)和家蠶中特有的基因5個(gè)。對(duì)篩選到的這7個(gè)基因的上游調(diào)控序列進(jìn)行克隆，成功構(gòu)建其中5個(gè)基因的雙熒光素酶報(bào)告載體。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示，5個(gè)篩選到的基因均受到BmFoxO的調(diào)控，其中 BGIBMGA002356基因受到的調(diào)控最為強(qiáng)烈。為了探測(cè)BGIBMGA002356基因是否參與家蠶壽命的調(diào)控過(guò)程，在家蠶蛹10天對(duì)其進(jìn)行了基因的雙鏈干涉實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明干涉BGIBMGA

13、002356基因后，其在羽化后12h的表達(dá)水平被顯著下調(diào)，同時(shí)家蠶成蟲(chóng)期壽命被顯著縮短。
　　綜上所述，我們證明了BmFoxO基因能夠調(diào)控家蠶壽命，同時(shí)鑒定到FoxO下游的一個(gè)新的靶基因BGIBMGA002356，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了該靶基因受到BmFoxO的直接調(diào)控，且能夠調(diào)控家蠶壽命。我們推測(cè)BGIBMGA002356可能參與了BmFoxO調(diào)控家蠶壽命的過(guò)程，這極有可能是FoxO調(diào)控壽命的一條新的路徑。本研究不僅進(jìn)一步豐富了我們對(duì)