C反應(yīng)蛋白對樹突狀細(xì)胞免疫功能的調(diào)控作用與分子機(jī)制.pdf

1、免疫炎癥反應(yīng)是冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(Coronary heart disease，CHD)發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制。C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是目前使用最廣泛的炎癥標(biāo)志物之一，并被一致認(rèn)為是CHD一個重要的風(fēng)險預(yù)測指標(biāo)。然而，關(guān)于CRP與CHD之間的因果關(guān)聯(lián)，目前國際上卻存在很大的爭議。
　　 樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)啟動并調(diào)控機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)，構(gòu)成CHD炎癥機(jī)

2、制的中心環(huán)節(jié)。在我們前期研究中，已發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白和糖基化終末產(chǎn)物等CHD危險因素能激活DCs免疫炎癥反應(yīng)，同時，也關(guān)注到一些抑制CHD進(jìn)展的物質(zhì)或藥物能減輕DCs免疫炎癥。文獻(xiàn)報道，DCs表達(dá)CRP受體--CD32，提示CRP對DCs具有一定的調(diào)節(jié)功能。但是，關(guān)于CRP是啟動還是抑制：DCs免疫炎癥，國際上存在完全相反的報道；而關(guān)于CRP調(diào)控DCs的分子機(jī)制，也極少有文獻(xiàn)報道。
　　 鑒于DCs在CHD慢性炎癥機(jī)制中的重要

3、地位以及文獻(xiàn)報道CRP對DCs免疫炎癥調(diào)控作用的分歧，尤其是CRP與CHD之間因果關(guān)聯(lián)的廣泛爭議，我們開展了本研究，探討CRP調(diào)控DCs的免疫功能及其分子機(jī)制，為進(jìn)一步闡明CRP與CHD的因果關(guān)聯(lián)提供證據(jù)。
　　 第一部分C反應(yīng)蛋白對樹突狀細(xì)胞免疫表型與功能的調(diào)控作用
　　 目的：探討CRP對DCs免疫表型、細(xì)胞因子分泌、以及刺激T細(xì)胞增殖等功能的影響。
　　 方法：(1)采用免疫磁珠分選CD14+單核細(xì)胞，經(jīng)細(xì)

4、胞因子誘導(dǎo)分化為人外周血單核源性樹突狀細(xì)胞(monocyte-derived dendritic cells，MoDC)；(2)分組：未干預(yù)組、不同濃度CRP(5，15，30μg/mL)組和脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，100ng/mL)陽性對照組，在48小時分別收集細(xì)胞與上清；(3)流式細(xì)胞技術(shù)檢測MoDC免疫表型；(4)定量PCR結(jié)合ELISA方法檢測IL-12、IL-10、TNF-α和IL-6炎癥細(xì)胞因子；

5、(5)免疫磁珠方法分選CD4+CD45RA+T細(xì)胞，分別將經(jīng)CRP(30μg/mL)和LPS(100 ng/mL)誘導(dǎo)48小時的MoDC與T細(xì)胞按照1:5、1:10和1:20比例進(jìn)行混合培養(yǎng)，采用同種異體混合T細(xì)胞增殖實驗來檢測CRP和LPS對T細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)果：(1)MoDC經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，培養(yǎng)成功；(2)流式細(xì)胞檢測結(jié)果表明，CRP(15和30μg/mL)上調(diào)CD80和CD86(p<0.05)，而對其他的免疫表型分

6、子(CD83、CD40和MHC-Ⅱ)作用并不明顯(p>0.05)，LPS顯著上調(diào)CD80、CD86、CD83、CD40和CD1a的表達(dá)(p<0.05)；(3)定量PCR和ELISA結(jié)果一致表明，CRP(30μg/mL)對IL-12的表達(dá)無明顯促進(jìn)作用(p>0.05)，對IL-10的表達(dá)有下降趨勢(p>0.05)；(4)CRP顯著下調(diào)TNF-α mRNA的表達(dá)(p<0.05)，對IL-6 mRNA表達(dá)無明顯作用(p>0.05)；而LPS顯

7、著上調(diào)細(xì)胞因子IL-12、IL-10、TNF-α和IL-6的表達(dá)(p<0.05)；(5)CRP不能促進(jìn)T細(xì)胞增殖，反而有一定的抑制趨勢(p>0.05)，LPS顯著促進(jìn)T細(xì)胞增殖反應(yīng)(p<0.05)，其中以DC：T=1:10作用最強(qiáng)。
　　 結(jié)論：(1)LPS促進(jìn)DCs成熟，并激活T細(xì)胞反應(yīng)，這與以往文獻(xiàn)報道一致，表明實驗體系穩(wěn)定。(2)CRP部分上調(diào)免疫表型分子，但并不上調(diào)炎癥因子分泌，也不能促進(jìn)T細(xì)胞增殖。有理由認(rèn)為，CRP誘

8、導(dǎo)DCs呈半成熟狀態(tài)，從而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)控和維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用。
　　 第二部分CRP與LPS刺激DCs的全基因組表達(dá)譜芯片檢測與分析
　　 目的：探討CRP與LPS兩者調(diào)控DCs免疫功能及其分子機(jī)制之間的異同。
　　 方法：(1)培養(yǎng)MoDC(來自3名健康男性獻(xiàn)血者)，分為對照組、CRP(30μg/mL)組和LPS(100 ng/mL)組，在48小時收集細(xì)胞，抽提RNA，采用Affymetrixaffymetr

9、ix u133 plus2.0表達(dá)譜芯片檢測其全基因組表達(dá)水平：(2)采用TwoClassDif方法進(jìn)行差異基因篩選；(3)采用在線MAS2.0軟件進(jìn)行基因功能(GO/Biological function)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(PATHWAY/KEGG)分子注釋分析；(4)基于CRP誘導(dǎo)DCs的差異表達(dá)基因，構(gòu)建信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)(Signal-Net)。
　　 結(jié)果：(1)RNA質(zhì)檢符合芯片要求；(2)CRP與對照組的差異基因有815個

10、，其中CRP特異誘導(dǎo)的差異基因為613個(432個上調(diào)/181個下調(diào))；LPS與對照組差異基因1477個，其中LPS特異誘導(dǎo)的差異基因為1303個(804個上調(diào)/499個下調(diào))。此外，有少數(shù)差異基因為CRP與LPS所共有；(3)CRP特異下調(diào)的差異基因中，與DCs免疫功能密切相關(guān)的顯著性GO主要包括：炎癥反應(yīng)和趨化；所參與的顯著性PATHWAY主要有：TOLL樣受體信號途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和細(xì)胞黏附分子信號途徑等；(4)

11、LPS特異上調(diào)的差異基因中，與DCs免疫功能密切相關(guān)的顯著性GO主要有：正調(diào)控NF-KB途徑、正調(diào)控IL-2合成與IL-4合成、正調(diào)控IL-6合成以及對γ-干擾素(IFN-)的反應(yīng)等；所參與的顯著性PATHWAY主要有：TOLL受體信號途徑、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體以及細(xì)胞黏附分子信號途徑、B細(xì)胞受體信號途徑和T細(xì)胞受體信號途徑等；(5)CRP差異基因分子注釋中，存在一些與脂代謝密切相關(guān)的基因所組成的顯著性GO如：脂蛋白代謝和膽固醇合成、

12、以及PATHWAY如：短鏈脂肪酸代謝途徑、脂聯(lián)素細(xì)胞因子信號途徑和PPAR-γ信號途徑等。(6)Signal-Net圖中所篩查到的基因主要有兩大類，一類為趨化因子和受體及其相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)均顯著下調(diào)，包括CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL7(MCP-3)、CXCL1～CXCL3、CX3CR1以及轉(zhuǎn)錄因子--活化T細(xì)胞核因子1等；另一類為調(diào)控細(xì)胞周期并與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，如CDKN1

13、B(p27.kip1)、CCND1、CCND2、CCNE2以及PTEN和FOXO1等。
　　 結(jié)論：高通量數(shù)據(jù)篩選結(jié)果揭示，(1)與LPS誘導(dǎo)DCs成熟和啟動免疫炎癥反應(yīng)相反，CRP抑制DCs免疫炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，包括炎癥細(xì)胞因子的合成以及趨化因子及其受體的表達(dá)；(2)CRP可能具有獨(dú)立于LPS的調(diào)控DCs參與脂代謝的作用；(3)CRP可能通過改變與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因的表達(dá)而影響DCs的壽命。
　　 第三部分 C反

14、應(yīng)蛋白調(diào)控樹突狀細(xì)胞維持免疫穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制的初步研究
　　 目的：驗證并檢測Signal-Net圖中CRP對DCs表達(dá)凋亡相關(guān)基因如PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kip1)的影響，探討CRP調(diào)控DCs以維持免疫穩(wěn)態(tài)的分子機(jī)制。
　　 方法：(1)培養(yǎng)MoDC，干預(yù)和分組同第二部分；(2)定量PCR驗證CRP和LPS對MoDC表達(dá)PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kip1)的影響；(3)Wester

15、n Blot檢測CRP和LPS對MoDC表達(dá)上述蛋白的作用，并檢測Caspase-7和PARP的表達(dá)；(4)采用流式細(xì)胞技術(shù)分析CRP和LPS對MoDC凋亡的影響。
　　 結(jié)果：(1)定量PCR和Western Blot結(jié)果均顯示，CRP顯著誘導(dǎo)PTEN和CDKN1B(p27.kip1)表達(dá)上調(diào)，對FOXO1也有一定上調(diào)作用；而LPS誘導(dǎo)FOXO1顯著上調(diào)，對CDKN1B(p27.kip1)表達(dá)也有上調(diào)趨勢；(2)Western

16、 Blot結(jié)果表明，CRP和LPS均上調(diào)Caspase-7和PARP的表達(dá)，并顯著增加其裂解產(chǎn)物；(3)CRP和LPS均能夠誘導(dǎo)MoDC發(fā)生凋亡。
　　 結(jié)論：(1)CRP上調(diào)PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kip1)的表達(dá)，其結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致；(2)CRP可能通過上調(diào)PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kip1)的表達(dá)，激活Caspase-7并裂解PARP，以誘導(dǎo)DCs凋亡，從而負(fù)向調(diào)控DCs免疫炎癥

17、并維持DCs免疫穩(wěn)態(tài)。
　　 全文總結(jié)
　　 1、與LPS誘導(dǎo)DCs成熟并啟動免疫炎癥相反，CRP誘導(dǎo)smDC形成，抑制DCs免疫炎癥相關(guān)基因，包括下調(diào)CC型和CXC型趨化因子的表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)控DCs免疫炎癥。
　　 2、CRP上調(diào)抑癌基因PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kip1)表達(dá)，激活Caspase-7并裂解PARP，以誘導(dǎo)DCs凋亡，從而維持DCs免疫穩(wěn)態(tài)。
　　 潛在價值和創(chuàng)新點(diǎn)<

18、br>　　 1、發(fā)現(xiàn)CRP誘導(dǎo)smDC形成，初步證明CRP抑制DCs免疫炎癥相關(guān)基因表達(dá)，包括誘導(dǎo)CC型和CXC型趨化因子表達(dá)下調(diào)，從而負(fù)向調(diào)控DCs免疫炎癥；
　　 2、初步揭示CRP通過上調(diào)抑癌基因PTEN、FOXO1和CDKN1B(p27.kip1)表達(dá)，激活Caspase-7并裂解PARP，從而誘導(dǎo)DCs凋亡，以維持DCs免疫穩(wěn)態(tài)；
　　 3、本實驗結(jié)果豐富了對DCs免疫炎癥調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識，為今后深入研究DCs