肝臟基質(zhì)微環(huán)境對(duì)免疫細(xì)胞分化和功能的調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肝臟具有非常獨(dú)特的免疫系統(tǒng).一方面,在肝臟中存在多種淋巴細(xì)胞,包括T細(xì)胞,NK細(xì)胞,NKT細(xì)胞等,它們可以識(shí)別病原微生物和毒素,啟動(dòng)免疫應(yīng)答以清除外來有害異物.另一方面,從小腸中吸收來的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過門靜脈進(jìn)入肝臟進(jìn)行代謝,同時(shí)也帶來了大量無害的食物抗原,目前的研究表明,從門靜脈進(jìn)入肝臟的抗原更容易誘發(fā)耐受,稱之為"門脈耐受現(xiàn)象". 因此,肝臟局部的免疫反應(yīng)需要非常精細(xì)的調(diào)節(jié),才能保證在特定的情況下正確選擇是啟動(dòng)免疫應(yīng)答還是誘導(dǎo)免疫

2、耐受.而對(duì)于這種調(diào)節(jié)的機(jī)制,目前所知甚少.除了抗原進(jìn)入的途徑不同外,肝臟中存在的多種免疫細(xì)胞也可以分布到全身其他地方,它們?yōu)楹卧诟闻K中既可以誘導(dǎo)免疫耐受,又可以激發(fā)免疫應(yīng)答?對(duì)這一問題的回答將研究的方向指向了肝臟的免疫微環(huán)境:此現(xiàn)象提示肝臟微環(huán)境具有獨(dú)特的功能,即可能通過對(duì)不同細(xì)胞的分化及功能進(jìn)行調(diào)控,從而可以在免疫應(yīng)答和維持耐受中發(fā)揮著重要作用. 作為構(gòu)成肝臟器官微環(huán)境的重要組成部分,基質(zhì)細(xì)胞在維持肝臟器官形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞、調(diào)節(jié)

3、器官內(nèi)細(xì)胞分化等多方面發(fā)揮重要作用.因而,我們選擇用肝臟基質(zhì)細(xì)胞來模擬肝臟微環(huán)境,觀察其對(duì)造血前體細(xì)胞或NK細(xì)胞的影響,希望可以在一定程度上反映肝臟微環(huán)境的效應(yīng),為深入闡明肝臟局部免疫反應(yīng)的精細(xì)調(diào)節(jié)提供新的視角. 首先,我們利用組織培養(yǎng)技術(shù)從新生小鼠肝臟中分離到肝臟基質(zhì)細(xì)胞,并對(duì)其細(xì)胞類型進(jìn)行了鑒定.免疫組織化學(xué)的結(jié)果表明:分離到的肝基質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)表達(dá) Vimentin 和Desmin,但不表達(dá)Cytokeratin-7, 亦不

4、分泌白蛋白;吞噬試驗(yàn)的結(jié)果表明:該細(xì)胞不吞噬LDL;而RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果則顯示:該細(xì)胞表達(dá)a-SMA 和多種基質(zhì)組份的mRNA,包括Ⅰ型膠原(al (I) collagen)、金屬蛋白酶組織抑制劑-1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2,但不表達(dá)GFAP .從以上結(jié)果來看,該細(xì)胞具有肝臟內(nèi)成纖維母細(xì)胞的特性.成纖維母細(xì)胞是肝臟基質(zhì)細(xì)胞中的主要細(xì)胞類型之一,主要分布在肝臟的門脈部位.肝內(nèi)大部分樹突狀細(xì)胞的主要定居部位也是在肝臟門脈部位.因而,肝臟內(nèi)樹

5、突狀細(xì)胞獨(dú)特的功能及表型可能與其定居局部附近的肝臟基質(zhì)細(xì)胞形成的局部微環(huán)境有關(guān). 為研究肝臟免疫微環(huán)境對(duì)前體細(xì)胞分化的效應(yīng),我們將骨髓來源的造血前體細(xì)胞與分離的肝臟基質(zhì)細(xì)胞共育.結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝臟基質(zhì)細(xì)胞能誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化為一類具有免疫調(diào)節(jié)功能的樹突細(xì)胞樣細(xì)胞 .從鏡下培養(yǎng)特性和染色后形態(tài)觀察:該細(xì)胞為髓樣細(xì)胞表現(xiàn),并伸出類似傳統(tǒng)意義上的DC(Conventional dendritic cells,cDCs)相似的樹突樣結(jié)構(gòu).流式

6、分析結(jié)果顯示:其表型特征為不表達(dá) CD4、CD8a、B220、Gr-1、CD14和B7DC;但低水平表達(dá)CDllc、I-A<'b>、CD54、CD40、CD86;中高水平表達(dá)CDllb、CD80、B7H-1.cDCs最重要的功能是能將抗原遞呈給抗原特異性T細(xì)胞,并誘導(dǎo)其活化與增殖.故而,我們利用OVA<,323-339>特異性TCR轉(zhuǎn)基因鼠的CD4<'+>T細(xì)胞,對(duì)LRDCs的抗原遞呈功能進(jìn)行了分析.發(fā)現(xiàn)LRDCs能將抗原遞呈給T細(xì)胞,

7、但不能有效地誘導(dǎo)CD4<'+>T細(xì)胞的增殖,僅能引起CD4<'+>T細(xì)胞一定程度的活化.另外,該細(xì)胞還呈現(xiàn)出較cDCs更強(qiáng)的吞噬功能.提示這是一群不同于cDCs的DC細(xì)胞. TLR(Toll-like receptors)是廣泛表達(dá)在免疫細(xì)胞表面的一類模式抗原識(shí)別受體,對(duì)于激活機(jī)體的天然免疫和過繼免疫有著非常重要的作用.當(dāng)LPS通過與表達(dá)在DC細(xì)胞表面的TLR4結(jié)合后,可促使DC成熟,高分泌IL-12,同時(shí)上調(diào)其MHC-Ⅱ類分子

8、表達(dá)及抗原遞呈功能.但LRDCs在受到LPS刺激后,高分泌IL-10、低分泌IL-12;其表型特征沒有明顯改變.而此特性與以前報(bào)道的調(diào)節(jié)性DC的特征相似.因此,我們?cè)O(shè)想該細(xì)胞是否也有免疫調(diào)節(jié)功能?利用CFSE標(biāo)記的OVA<,323-339>肽抗原特異性轉(zhuǎn)基因鼠的CD4<'+>T進(jìn)行的體內(nèi)、體外抗原特異性增殖試驗(yàn)結(jié)果表明:LRDCs明顯抑制cDCs激活的OVA<,323-339>肽抗原特異性CD4<'+>T的增殖反應(yīng).此結(jié)果說明:LRDC

9、s有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能. 那么基質(zhì)細(xì)胞是通過何種機(jī)制來誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化為L(zhǎng)RDCs的?分化的LRDCs又是通過何種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原特異性激活的CD4<'+>T細(xì)胞的增殖抑制?我們利用Transwell培養(yǎng)體系和純化的基質(zhì)細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明:基質(zhì)細(xì)胞膜蛋白與其培養(yǎng)上清都在誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化為L(zhǎng)RDCs中起作用;其中,主要以細(xì)胞培養(yǎng)上清為主.進(jìn)一步利用抗體阻斷試驗(yàn)進(jìn)行的研究結(jié)果表明:阻斷基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中的M-CSF可以大大降低基

10、質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)前體細(xì)胞分化為L(zhǎng)RDCs的效率.說明基質(zhì)細(xì)胞分泌的M-CSF在LRDCs的分化中起一定的作用.為進(jìn)一步闡明LRDCs體外抑制抗原特異性T細(xì)胞活化增殖的機(jī)制,我們針對(duì)LRDCs的特性,分別用IL-10、TGF-β、B7H-1的中和性抗體、PGE<,2>的阻斷劑消炎痛及IDO抑制劑來阻斷LRDCs的生物學(xué)效應(yīng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)PGE<,2>的阻斷劑消炎痛能大部分逆轉(zhuǎn)LRDCs對(duì)T細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng).此結(jié)果說明:LRDCs在一定程度上是通過

11、分泌PGE<,2>來實(shí)現(xiàn)其免疫抑制功能的. IFN-Y是一類主要由活化的Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子.在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)LRDCs在抑制OVA<,323-339>肽抗原特異性CD4<'+>T細(xì)胞增殖時(shí),其共培養(yǎng)上清中IFN-Y分泌水平上調(diào).考慮到IFN-Y在免疫耐受與免疫負(fù)向調(diào)節(jié)中的作用,我們不禁要問:高分泌的IFN-Y是否也是LRDCs負(fù)向調(diào)節(jié)功能的機(jī)制之一呢?鑒于IFN-Y參與誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞發(fā)生凋亡,那么在LRDCs的效應(yīng)中

12、除了CD4<'+>T細(xì)胞增殖抑制外,是否還有活化CD4<'+>T細(xì)胞的凋亡發(fā)生?為此,我們首先分析了實(shí)驗(yàn)各組中的CD4<'+>T細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果發(fā)現(xiàn):LRDCs能夠誘導(dǎo)活化的CD4<'+>T細(xì)胞發(fā)生凋亡.利用中和性抗IFN-Y抗體進(jìn)行的阻斷試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí):當(dāng)IFN-Y被阻斷后,LRDCs介導(dǎo)的抗原特異性T細(xì)胞增殖抑制現(xiàn)象被部分逆轉(zhuǎn),同時(shí),凋亡發(fā)生率也下調(diào).這一結(jié)果表明加入LRDCs共培養(yǎng)后,上清中高分泌的IFN-y是其抑制抗原特異性T

13、細(xì)胞增殖和誘發(fā)其凋亡的又一機(jī)制. 為進(jìn)一步利用體內(nèi)試驗(yàn)說明LRDCs的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能,我們還利用冰浴勻漿+超速離心法制備的正常小鼠自身肝臟抗原(S100)和福氏完全佐劑共同免疫小鼠,制備了小鼠自身免疫性肝炎的模型,并利用此模型來研究過繼的LRDCs細(xì)胞是否對(duì)此自身免疫病的發(fā)生也有抑制效應(yīng).動(dòng)物試驗(yàn)的結(jié)果表明:LRDCs的過繼能夠減輕該模型的病理損害. 由于體外實(shí)驗(yàn)表明:LRDCs是由骨髓造血前體細(xì)胞經(jīng)肝臟基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分

14、化而來,那么體內(nèi)的相應(yīng)群體是否也可由造血前體分化而來?為證明此假設(shè),我們建立了經(jīng)腸系膜靜脈過繼前體細(xì)胞進(jìn)入肝內(nèi),進(jìn)行了肝內(nèi)前體細(xì)胞原位發(fā)育的實(shí)驗(yàn)研究.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:將骨髓來源的造血前體細(xì)胞經(jīng)腸系膜靜脈過繼后,前體細(xì)胞主要滯留在肝內(nèi)并可完成肝內(nèi)的原位分化發(fā)育.經(jīng)流式分析過繼GFP造血前體細(xì)胞分化后的表型結(jié)果說明,骨髓來源的造血前體細(xì)胞在肝內(nèi)分化成多群細(xì)胞,其中包括與LRDCs有相似表型的細(xì)胞群.此結(jié)果在體內(nèi)證明了肝臟內(nèi)LRDCs的相應(yīng)群體

15、也可由骨髓來源的造血前體細(xì)胞分化而來.以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,肝臟微環(huán)境可以促進(jìn)造血前體細(xì)胞分化為具有免疫負(fù)向調(diào)節(jié)功能的樹突狀細(xì)胞,這一效應(yīng)可能參與肝臟免疫耐受的形成. 我們利用肝基質(zhì)細(xì)胞模擬肝臟微環(huán)境研究了其對(duì)NK細(xì)胞分化、趨化及活化等生物學(xué)特性的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn):骨髓來源的Lin'CD117<'+>在外源性IL-15存在條件下,與肝基質(zhì)細(xì)胞共育后,部分前體細(xì)胞可分化成NK1.1陽性細(xì)胞.該細(xì)胞能分泌IFN-y、并表達(dá)Perfrin和

16、Granzyme B.其中,部分分化的NK1.1陽性細(xì)胞還表達(dá)Ly49A,表現(xiàn)出了immature NK細(xì)胞的細(xì)胞特性.進(jìn)而利用Transwell培養(yǎng)體系和阻斷性抗體的試驗(yàn)結(jié)果表明,該immature NK細(xì)胞的分化同時(shí)依賴IL-15和肝基質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子. 我們還利用該基質(zhì)細(xì)胞模擬肝臟微環(huán)境研究了其對(duì)外周NK細(xì)胞趨化、活化的影響.結(jié)果表明:NK細(xì)胞表達(dá)TLR3,并能被Poly I∶C所活化.肝基質(zhì)細(xì)胞可通過分泌的因子趨化N

17、K細(xì)胞,尤其是Poly I∶C活化的NK細(xì)胞向基質(zhì)細(xì)胞粘附,而且,肝臟基質(zhì)細(xì)胞還可以促進(jìn)Poly I∶C活化的NK細(xì)胞的進(jìn)一步活化,表現(xiàn)為IFN-γ分泌的增加及NK細(xì)胞殺傷活性的增強(qiáng).這一促進(jìn)效應(yīng)是通過基質(zhì)細(xì)胞表面表達(dá)的Fibronectin與NK細(xì)胞表面的配體結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的.以上結(jié)果提示肝臟免疫微環(huán)境可以促進(jìn)NK細(xì)胞的肝內(nèi)分化、外周趨化及在肝內(nèi)的活化功能進(jìn)一步增強(qiáng),此效應(yīng)可能參與肝臟內(nèi)對(duì)外源性病原微生物的免疫應(yīng)答的啟動(dòng). 綜上所

18、述,在本研究中,我們?cè)隗w外分離培養(yǎng)了成纖維樣肝臟基質(zhì)細(xì)胞,利用該細(xì)胞來模擬肝臟的免疫微環(huán)境,觀察了其對(duì)造血前體細(xì)胞和NK細(xì)胞的不同效應(yīng).結(jié)果發(fā)現(xiàn),肝臟基質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)造血前體細(xì)胞分化成具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的樹突狀細(xì)胞,同時(shí),在IL-15存在的條件下,可以促進(jìn)部分前體細(xì)胞分化為Immature NK細(xì)胞.并可以促進(jìn)活化NK細(xì)胞的進(jìn)一步的活化.以上結(jié)果提示,肝臟的免疫微環(huán)境可能通過對(duì)肝臟內(nèi)不同細(xì)胞的不同調(diào)控作用,來實(shí)現(xiàn)肝臟對(duì)特定抗原誘導(dǎo)免疫