Toll樣受體2與肝癌發(fā)生機制研究.pdf

1、肝癌是一種死亡率較高、嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。慢性病毒感染、代謝異常以及毒性攝入等都是肝癌發(fā)生的重要原因。肝癌的發(fā)生除了與肝實質細胞本身的基因突變有關之外，與所處的免疫微環(huán)境關系密切，包括腫瘤局部的細胞因子、趨化因子等蛋白的表達變化，抑制性免疫細胞（包括調節(jié)性T細胞，M2型巨噬細胞或是髓系來源的抑制性細胞）的浸潤和抗腫瘤細胞(NK細胞，CD8+T細胞)的耗竭等諸多方面。抑制性細胞因子IL-10，TGF-β等上調表達以及免疫抑制細

2、胞的聚集是腫瘤發(fā)生時普遍存在的現象，也成為腫瘤免疫治療的關鍵干預靶點。
　　Toll樣家族分子在腫瘤進程中的作用已經多有報道，不同的TLR分子可能發(fā)揮不同的作用，探明不同的TLR分子在腫瘤發(fā)生中的作用對腫瘤治療具有重要意義。TLR7，TLR8，TLR9激動劑可以用于治療小鼠腫瘤，已經進入臨床研究階段。本研究中我們首次證明TLR2激動劑可以用于肝癌的治療。我們首先采用流式細胞術檢測了化學藥物誘發(fā)的肝癌中肝細胞上TLR2分子的表達;之

3、后采用TLR2缺陷小鼠，通過組織染色、免疫組化以及熒光定量PCR等方法檢測了TLR2在肝癌發(fā)生發(fā)展中的表達動力學;接著我們通過腫瘤判定，流式分析細胞亞群變化，免疫印跡等方法發(fā)現caspase-8-IL-18-MDSC軸的過度活化是TLR2缺陷鼠易感腫瘤的原因;同時采用IL-18過表達質粒注射、IL-18沉默、caspase-8干擾等技術，證明TLR2對caspase-8-IL-18軸的負調效應;最后激動劑活化TLR2，實現了對肝癌小鼠的

4、免疫治療。
　　基于以上研究思路以及實驗方法，我們取得了以下實驗結果:
　　1.肝癌發(fā)生過程中TLR2分子表達下調和TLR2活化能夠抑制腫瘤生長本研究建立小鼠自發(fā)肝癌模型來研究TLR2分子在肝癌發(fā)生中的作用。在化學藥物二乙基亞硝胺誘導8個月后所有小鼠均發(fā)生肝癌。通過流式細胞術以及蛋白質免疫印跡等方法，我們發(fā)現肝細胞上TLR2分子表達下調。同時我們采用TLR2激動劑Pam3CSK4進行DEN腫瘤模型小鼠TLR2信號的長期活化，

5、發(fā)現TLR2分子活化后能夠減緩肝癌的發(fā)生。這些研究結果說明TLR2分子可能在肝癌發(fā)生中發(fā)揮作用。
　　2.TLR2缺陷鼠易感自發(fā)性肝癌此后，我們引入TLR2缺陷小鼠進行DEN腫瘤模型的誘導。TLR2缺陷小鼠在誘導8個月以后能夠發(fā)生更加嚴重的腫瘤。組織病理學分析能夠看到更大的腫瘤區(qū)域，并且肝細胞表現更強的細胞增殖能力(PCNA+)。同時通過熒光定量PCR的方法能夠檢測到更多腫瘤指標甲胎蛋白(AFP)的表達，說明TLR2分子在小鼠自發(fā)

6、肝癌中起保護作用。
　　3.TLR2缺陷鼠中免疫細胞處于耗竭狀態(tài)我們同時檢測了腫瘤小鼠中免疫細胞的狀態(tài)。盡管T細胞在DEN誘導的肝癌模型中的作用在免疫缺陷鼠(Rag1-/-)中已得到確認，但是在TLR2缺陷鼠中所處狀態(tài)還不清楚。我們發(fā)現，DEN處理后TLR2缺陷鼠肝臟以及脾臟CD8+T細胞高表達PD-1，同時產生TNF-α以及穿孔素的能力降低。這些結果說明TLR2缺陷鼠在DEN誘導后免疫細胞處于耗竭狀態(tài)。
　　4.TLR2缺

7、陷小鼠經DEN誘導以后表達更多的髓系來源抑制樣細胞小鼠經DEN誘導之后，單核樣MDSC（CD45+CD11 b+Ly6G-Ly6Chigh）在TLR2缺陷小鼠各臟器中均表達升高。對單核樣MDSC進行時間動力學監(jiān)測，發(fā)現在DEN誘導5月以后TLR2缺陷小鼠肝臟中MDSC明顯多于野生鼠。同時，TLR2缺陷鼠的肝臟中表達較高水平的iNOS，并且阻斷其表達后能夠恢復T細胞功能。此外，我們對來源于野生鼠以及TLR2缺陷小鼠的MDSC的功能進行了比

8、較，發(fā)現兩者抑制T細胞增殖以及產生IFN-γ的能力沒有區(qū)別，并且兩者活化表型相似。只有TLR2缺陷鼠的MDSC表達較高水平的ki-67，這些實驗結果說明來源于TLR2缺陷鼠的單核樣MDSC是通過增加MDSC的數量，進而產生大量的iNOS來發(fā)揮抑制T細胞功能的。
　　5.來源于肝細胞的IL-18能夠誘導髓系來源的抑制樣細胞產生接下來，我們就對MDSC增多的機制進行了探索。首先，通過熒光定量PCR的方法，我們對多種細胞因子進行了檢測。

9、結果發(fā)現只有IL-18的mRNA在TLR2缺陷鼠中是上調表達的。并且通過免疫組化以及蛋白質免疫印跡實驗可以看到IL-18主要是由肝實質細胞產生的。在TLR2缺陷鼠中觀察到IL-18與MDSC表達的正相關性，提示我們IL-18可能具有誘導MDSC的作用。為了驗證這一猜測，我們首先檢測了MDSC上IL-18受體的表達，發(fā)現DEN處理后單核樣MDSC上確實表達較高水平的IL-18受體。同時我們通過體外培養(yǎng)以及體內IL-18過表達實驗也證實了I

10、L-18能夠誘導MDSC產生。
　　6.肝細胞特異性干擾IL-18能夠降低髓系來源的抑制樣細胞的聚集并減緩腫瘤的發(fā)生我們進行了體內干擾實驗驗證IL-18對MDSC以及腫瘤發(fā)生的影響。當在腫瘤發(fā)生過程中使用高壓注射的方式干擾掉肝細胞中IL-18的表達以后，盡管在野生鼠中沒有看到腫瘤發(fā)生程度的區(qū)別，干擾IL-18的表達能夠明顯減輕TLR2缺陷小鼠的腫瘤發(fā)生程度，同時單核樣MDSC的細胞比例明顯下調，CD8+T細胞功能得到恢復。

11、　　7.TLR2缺陷鼠中IL-18的產生依賴于caspase-8我們對TLR2分子調控IL-18的機制進行了探究。在DEN處理后，TLR2缺陷小鼠肝臟中表達更高水平的caspase-8，而當使用Pam3CSK4進行活化后caspase-8的表達降低，這就提示我們caspase-8可能與IL-18的產生有關。因此，我們構建了caspase-8的干擾質粒對肝細胞進行特異性干擾，結果發(fā)現在TLR2缺陷鼠中干擾caspase-8以后，血清ALT

12、以及IL-18的表達水平明顯降低，說明TLR2分子調控IL-18的表達是通過caspase-8來完成的。
　　8.TLR2激動劑Pam3CSK4處理能夠降低髓系來源的抑制樣細胞聚集并且恢復抗腫瘤免疫應答根據之前的研究結果，我們發(fā)現TLR2激動劑能夠減緩腫瘤的發(fā)生。在本部分研究中，我們發(fā)現Pam3CSK4處理后能夠同時降低單核樣以及粒細胞樣MDSC的比例以及細胞絕對數。血清中IL-18的表達水平在TLR2活化后明顯降低。此外，我們發(fā)

13、現TLR2激動劑處理后能夠明顯上調活化的CD8+T細胞的比例以及絕對數。同時，在抗腫瘤免疫中起重要作用的細胞因子的表達得到明顯恢復。這些結果說明TLR2激動劑能夠通過抑制IL-18-MDSC-CTL軸來減緩腫瘤的發(fā)生。
　　結論:我們的研究揭示了在肝癌發(fā)病過程中TLR2分子扮演的重要角色。TLR2分子缺失能夠加劇IL-18介導的免疫抑制，而TLR2活化則能夠逆轉這一機制并最終減緩腫瘤的發(fā)生。這一研究成果為肝癌的免疫治療提供了新的思