人蛔蟲CPI基因的全長克隆與免疫學(xué)功能初步研究.pdf

1、蠕蟲類寄生蟲感染可以顯著抑制宿主免疫功能這一現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛報(bào)道，但對這類寄生蟲中起免疫調(diào)控作用的分子所知甚少。許多研究表明，蠕蟲分泌排泄產(chǎn)物中的半胱氨酸蛋白酶抑制因子（Cysteine Protease Inhibitor，CPI）具有顯著的免疫抑制功能，然而其作用機(jī)理和應(yīng)用價(jià)值仍需深入研究。人蛔蟲（Ascaris lumbricoides，Al）是一種人體常見的腸道寄生蠕蟲，其體腔液和提取物具有抗過敏反應(yīng)、抗腫瘤等免疫調(diào)控功能。然而人

2、蛔蟲中具有免疫調(diào)控活性的分子有哪些仍然不甚明確。
　　 本文針對人蛔蟲中的半胱氨酸蛋白酶抑制因子進(jìn)行研究。本研究首先根據(jù)已知線蟲半胱氨酸蛋白酶抑制因子的保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，從人蛔蟲cDNA中擴(kuò)增得到人蛔蟲CPI的保守區(qū)序列片段。再利用RACE技術(shù)，成功克隆了人蛔蟲CPI全長cDNA序列。將Al-CPI的編碼區(qū)克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-32a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌origami之后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)和親和層析柱純化，得到重組Al-CPI蛋白

3、。重組CPI蛋白進(jìn)行生物活性測定，發(fā)現(xiàn)該蛋白可以抑制Cathepsin B、L、S、C四種組織蛋白酶對其相應(yīng)底物的水解作用，證明該蛋白具有生物活性。進(jìn)一步研究Al-CPI的免疫學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)Al-CPI可抑制由ConA、PPD等刺激引起的人PBMC的增殖活性，并可以顯著降低PBMC中ConA刺激誘導(dǎo)的IL-4和IFN-γ的分泌。流式細(xì)胞術(shù)檢測PBMC中不同T細(xì)胞亞群的表面分子，發(fā)現(xiàn)ConA刺激引起的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞表面CD2

4、5和HLA-DR的表達(dá)均被CPI抑制。這說明Al-CPI具有顯著的免疫抑制功能。在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（Mixed Lymphocyte Reaction，MLR）中，Al-CPI可以抑制應(yīng)答細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞的增殖能力。MLR體系中CD14+單核細(xì)胞表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)在CPI作用下均下調(diào)。同時，在MLR培養(yǎng)上清中IL-12和IFN-γ的分泌均可被CPI抑制。這說明人蛔蟲CPI可以抑制同種異型抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)