廣州管圓線蟲脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白(AcFAR)基因的克隆表達及其免疫學(xué)功能初步研究.pdf

1、廣州管圓線蟲(Angiostrongylus cantonensis(Chen，1935) Dougherty,1946)廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)，系以動物為宿主的寄生蟲，主要寄生于鼠肺部血管，陳心陶(1933，1935)首先在廣州的家鼠和褐家鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該蟲，命名為廣州肺線蟲(Pulmonema cantonensis Chen)，1937年在臺灣報道，1946年訂正為本名。在一些情況下，廣州管圓線蟲也可侵入人體，成為引起人體嗜酸性粒

2、細胞增多性腦膜炎或腦炎的重要病原體。人生吃或半生吃含有廣州管圓線蟲活幼蟲的福壽螺或淡水魚、蝦、蟹后即可感染。 廣州管圓線蟲病是由廣州管圓線蟲的幼蟲(偶或成蟲)寄生于人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致的疾病。該病為人獸共患病，主要臨床表現(xiàn)為劇烈頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、發(fā)熱、昏迷、精神失常、頸項強直等腦膜炎刺激征。嚴重者可造成死亡或有后遺癥。 目前在我國有報道的廣州管圓線蟲中間宿主有福壽嫘(Pom acea canaliculata，La

3、m arck，1822)、褐云瑪瑙螺、皺疤堅螺、短梨巴蝸牛、同型巴蝸牛、中華園田螺、環(huán)棱螺及蛞蝓等。隨著飲食的多樣化，福壽螺養(yǎng)殖范圍的擴大和交通運輸?shù)娜找姘l(fā)達，生吃水生植物、半生螺類、喝生水或食用吞入了螺苗級螺的小魚小蝦已成為一些人的習(xí)慣，特別是福壽螺養(yǎng)殖后管理不善，加速了廣州管圓線蟲病的傳播。因螺苗級螺較小，誤吃了也不易被發(fā)現(xiàn)，因此就診時患者常否認食用過螺，從而增加了醫(yī)生的診斷難度，造成人為的誤診而耽誤治療。 本病出現(xiàn)南病北移

4、的趨勢。該病2006年6-9月在北京局部小規(guī)模的爆發(fā)即是這一趨勢的最新印證。該病發(fā)病率近年來明顯上升。 目前，有關(guān)廣州管圓線蟲的生長發(fā)育、致病機制以及高效快速診斷方法的研究正在逐步進行，這些研究的全面開展對廣州管圓線蟲病的防治具有重大意義。 廣州管圓線蟲病診斷目前主要是以病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢查為主，根據(jù)病人發(fā)病前2周內(nèi)有進食未煮熟的淡水螺肉、蝸牛肉等飲食史，結(jié)合有腦膜腦炎的臨床表現(xiàn)，周圍血液及腦脊液中嗜酸性粒細胞明顯增多

5、，病原治療效果好等可作出本病的臨床診斷。但明確診斷則有賴于在腦脊液中發(fā)現(xiàn)廣州管圓線蟲幼蟲，在血清、腦脊液中檢出特異性可溶抗原和(或)特異性IgM、IgG。廣州管圓線蟲病目前的診斷方法血清學(xué)檢查，它的診斷抗原主要是粗抗原、代謝抗原等。由于天然抗原存在來源困難，難以標準化的問題及檢出的特異性和敏感性不是很理想，因此，有必要建立一種快速、敏感、特異的免疫診斷方法。應(yīng)用基因工程技術(shù)合成重組抗原，不僅可以解決天然抗原的來源不足問題，同時可望進一步

6、提高診斷的敏感性和特異性。 研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)抗原并非通過其完整分子發(fā)揮功能，而是通過其表位體現(xiàn)其特異性。脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白(fatty acid—and retinol—binding protein，F(xiàn)AR)為一類既能結(jié)合脂肪酸，又能結(jié)合視黃醇(維生素A)的蛋白家族。它們富含α螺旋、大小約為20000 Mr,迄今只在線蟲中發(fā)現(xiàn)，在其它動物中還沒有發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)蛋白。線蟲脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白(FARs)能促進脂肪酸和視黃醇的攝

7、取、運輸和分布到特定組織部位，在線蟲寄生生活中起關(guān)鍵作用，與線蟲的致病、侵入宿主有關(guān)。找到一個合適的抗原表位，就可能研制出針對該抗原的抗體或疫苗。FARs是與寄牛線蟲致病、寄生生活有關(guān)的重要分子，有必要探討FARs及其表位在廣州管圓線蟲體內(nèi)的作用。 研究目的： 從廣州管圓線蟲幼蟲cDNA噬菌體文庫中，識別出脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白(fatty acid and retinol—binding protein)基因(命名為A

8、cFAR)全長cDNA編碼序列，對其結(jié)構(gòu)進行理論分析、功能預(yù)測以及表位分析；克隆全長基因和表位基因并原核表達，獲得重組蛋白；分析AcFAR全長基因免疫反應(yīng)性并鑒定其在廣州管圓線蟲幼蟲發(fā)育階段的表達，初步探討AcFAR全長基因和表位基因的相互識別，并為研究其在生長發(fā)育和致病過程中所起的作用奠定基礎(chǔ)。 研究方法： 1、AcFAR基因的生物信息學(xué)分析 廣州管圓線蟲幼蟲cDNA噬菌體文庫進行表達序列標簽(expressi

9、on sequence tag，EST)隨機測序和unigene歸并、拼接，獲得多個廣州管圓線蟲幼蟲全長基因。用BLASTx方法搜索GenBank中與之同源的蛋白序列，從中識別出AcFAR基因。利用生物信息學(xué)軟件Motifscan、Predictprotein、SignalP、Swiss—Model等對該基因進行結(jié)構(gòu)和功能分析，預(yù)測AcFAR蛋白的空間結(jié)構(gòu)和功能。 2、AcFAR基因的克隆、表達、純化和免疫原性、免疫反應(yīng)性分析

10、 2.1 AcFAR基因的擴增、克隆 根據(jù)目的基因的ORF和原核表達質(zhì)粒pET—28b(+)酶切位點，利用軟件DNAClub和PCRdesign設(shè)計引物，PCR擴增AcFAR基因，限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、xhoⅠ雙酶切空質(zhì)粒pET—28b(+)和PCR產(chǎn)物，T4連接酶連接。用PCR、酶切及測序鑒定重組質(zhì)粒。 2.2 AcFAR基因的表達和純化 將pET—28b(+)—AcFAR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/D

11、E3中，在IPTG誘導(dǎo)下表達融合蛋白，并經(jīng)SDS—PAGE鑒定，重組蛋白上清用親和層析純化。 2.3 AcFAR重組蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性分析 2.3.1免疫血清的制備 用純化的AcFAR蛋白免疫SD大鼠，制備大鼠抗AcFAR重組蛋白的免疫血清，并進行血清預(yù)吸附。 2.3.2感染廣州管圓線蟲SD大鼠血清的制備 收集福壽螺，取出螺肉，剁碎，20ml消化液/g螺肉(0.2％的胃蛋白酶(w/v)，0

12、.7％鹽酸(v/v)，37℃溫育2h，光學(xué)解剖鏡下挑出廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲。收集廣州管圓線蟲第Ⅲ期幼蟲，灌胃感染。感染成功后取血，分離血清，—80℃保存?zhèn)溆谩?2.3.3 AcFAR的免疫原性和免疫反應(yīng)性分析 通過Western blotting方法，分別用上述制備的大鼠血清為一抗，分析純化的重組蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性。 2.4 AcFAR在幼蟲階段的表達 Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cD

13、NA，用特異性引物，以cDNA為模板擴增目的基因，判斷目的基因在幼蟲階段的表達情況。 3、廣州管圓線蟲AcFAR表位基因的原核克隆表達及其與全長蛋白的相互識別 3.1 AcFAR表位基因的擴增、克隆 利用http://tools.immuneepitope.org/tools的BepiPred分析工具預(yù)測B細胞線性表位，根據(jù)原核表達質(zhì)粒pGEX—4T-1(+)酶切圖譜選擇酶切位點，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成帶

14、有酶切位點的表位，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切空質(zhì)粒pGEX—4T-1(+)，T4連接酶連接。用測序鑒定重組質(zhì)粒。 3.2 AcFAR表位基因的表達和純化 將pGEX—4T-1(+)—表位重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21/DE3中，在IPTG誘導(dǎo)下表達融合蛋白，并經(jīng)SDS—PAGE鑒定，重組蛋白上清用親和層析純化。 3.3 AcFAR表位重組蛋白和全長重組蛋白的相互識別 3.3.1免疫血清的制備

15、 用純化的AcFAR表位蛋白免疫SD大鼠，制備大鼠抗AcFAR表位重組蛋白的免疫血清，并進行血清預(yù)吸附。 2.3.3 AcFAR表位重組蛋白與全長重組蛋白的相互識別 通過Western blotting方法，一抗(1:1000)分別用大鼠陰性血清，全長免疫大鼠血清；二抗(1:2，000)為兔抗大鼠IgG—HRP溶液，分析廣州管圓線蟲幼蟲AcFAR表位重組蛋白與AcFAR重組蛋白抗血清的識別；一抗(1:1000)分別用

16、大鼠陰性血清，全長重組蛋白免疫大鼠血清，小鼠陰性血清，表位重組蛋白免疫大鼠血清；二抗(1:2，000)為兔抗大鼠IgG—HRP溶液，羊抗小鼠IgG—HRP溶液，分析廣州管圓線蟲幼蟲AcFAR重組蛋白與AcFAR表位重組蛋白抗血清的識別。 研究結(jié)論： 1、從廣州管圓線蟲幼蟲的cDNA文庫中識別出AcFAR基因，AcFAR全長654個核昔酸，編碼181個氨基酸，含有1個線蟲脂肪酸與視黃醇結(jié)合蛋白位點。 2、成功構(gòu)建了

17、pET—28b—AcFAR原核表達載體，細菌培養(yǎng)物經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達出重組蛋白，純化得到重組蛋白。ELISA結(jié)果顯示AcFAR重組蛋白能夠刺激大鼠產(chǎn)生特異性抗體。Western Blotting結(jié)果表明該重組蛋白具有免疫原性和免疫反應(yīng)性。 3、RT—PCR結(jié)果顯示：該基因在幼蟲時期有表達。 4、成功構(gòu)建了pGEX—4T-1(+)—表位原核表達載體，細菌培養(yǎng)物經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達出重組蛋白，純化得到重組蛋白。細菌培養(yǎng)物經(jīng)