日本血吸蟲(chóng)TβRII基因全長(zhǎng)cDNA的克隆及其胞外段免疫保護(hù)功能的研究.pdf

1、日本血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的人畜共患寄生蟲(chóng)病，蟲(chóng)卵沉積于肝、腸等組織中形成蟲(chóng)卵肉芽腫及其纖維化是蟲(chóng)體致病的最主要原因。目前，血吸蟲(chóng)病疫苗的研制是血吸蟲(chóng)病防治工作的重點(diǎn)之一。
　　 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞外基質(zhì)的形成和免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用[1-8]，且TGF-β1是目前公認(rèn)的最強(qiáng)的肝

2、纖維化促進(jìn)因子之一[9]。TGF-β在日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum，S.j）自身的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，以及在蟲(chóng)體與宿主的相互作用中都發(fā)揮著重要作用[10]。TGF-β超家族包括一系列具有類(lèi)似的結(jié)構(gòu)和功能的生長(zhǎng)因子家族肽類(lèi)。TβR（TGF-β受體）有多種，其中Ⅰ型（TβRⅠ）、Ⅱ型（TβRⅡ）、Ⅲ型（TβRⅢ）分布于多類(lèi)細(xì)胞膜上。TβRⅠ和TβRⅡ在TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主導(dǎo)作用，TβRⅡ具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，

3、在生理濃度下可單獨(dú)與TGF-β結(jié)合，結(jié)合后TβRⅡ胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，再與TβRⅠ結(jié)合形成TGF-β-TβRⅡ-TβRⅠ復(fù)合體，隨之TβRⅠ胞內(nèi)段發(fā)生磷酸化，引起下游smad蛋白家族的一系列變化，從而將信號(hào)傳遞于細(xì)胞胞核內(nèi)[11,12]，調(diào)控目的基因表達(dá)。由此推測(cè)SjTβRⅡ在SjTGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中亦發(fā)揮著重要的樞紐作用。曼氏血吸蟲(chóng)(Schistosoma mansoni S.m) TβRⅡ可通過(guò)激活TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)抱雌溝蛋白

4、（Gynecophoral canal protein,GCP）表達(dá)，表明其在雄蟲(chóng)促雌蟲(chóng)發(fā)育成熟方面起著重要作用，提示TβRⅡ可作為疫苗候選分子。
　　 研究目的：
　　 鑒于SjTβRⅡ在蟲(chóng)體TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能發(fā)揮著重要的樞紐作用，以及作為疫苗候選分子的潛在性，本文擬用分子生物學(xué)等技術(shù)，獲得SjTβRⅡ全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其編碼序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；克隆和原核表達(dá)胞外段（SjTβRⅡout），且對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免

5、疫活性檢測(cè)；將重組蛋白免疫動(dòng)物，評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)性效果；測(cè)定SjTβRⅡ在成蟲(chóng)、蟲(chóng)卵中的定位和轉(zhuǎn)錄水平。
　　 研究方法：
　　 （1）SjTβRⅡ基因全長(zhǎng)cDNA序列由上海英濰捷基生物技術(shù)（Invitrogen）有限公司通過(guò)RACE方法擴(kuò)增獲得。利用GeneBank，ExPASy等對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)特異性引物，提取成蟲(chóng)總RNA進(jìn)行RT-PCR，對(duì)SjTβRⅡ基因全長(zhǎng)編碼基因（ORF）進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增

6、、TA克隆。
　　 （2）特異擴(kuò)增SjTβRⅡ基因胞外段（SjTβRⅡout），亞克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+)，構(gòu)建pET28a(+)-SjTβRⅡout重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。純化重組蛋白并免疫大鼠制備抗血清，應(yīng)用Western Blotting方法初步鑒定重組蛋白。
　　 （3）用免疫組織化

7、學(xué)法檢測(cè)目的基因在蟲(chóng)體中的定位；采用熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)SjTβRⅡ基因在雌蟲(chóng)、雄蟲(chóng)、蟲(chóng)卵、尾蚴的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　 （4）用SjTβRⅡout免疫小鼠，評(píng)價(jià)其動(dòng)物免疫保護(hù)性效果。動(dòng)物隨機(jī)分成3組:A組為SjTβRⅡout重組蛋白免疫組，B組為SjGST蛋白免疫組（陽(yáng)性對(duì)照組），C組為佐劑對(duì)照組。以減蟲(chóng)率和每克肝內(nèi)蟲(chóng)卵減少率對(duì)目的基因動(dòng)物免疫保護(hù)性效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 研究結(jié)果：
　　 （1）應(yīng)用RACE

8、方法獲得SjTβRⅡ基因的全長(zhǎng)cDNA序列，所測(cè)序列長(zhǎng)2867 bp，其ORF序列為2283bp，包括110 bp 5’UTR和474 bp 3’UTR（含有AATAAA和poly A等轉(zhuǎn)錄終止修飾點(diǎn)）。以成蟲(chóng)總RNA為模板，應(yīng)用特異性引物經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得約2300bp特異條帶，與預(yù)期分子量大小一致。將構(gòu)建的TA克隆重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，出現(xiàn)與目的基因相符的條帶，同時(shí)測(cè)序結(jié)果表明該序列與Invitrogen公司應(yīng)用RACE方法獲得

9、的SjTβRⅡ基因cDNA序列完全一致。SjTβRⅡ基因cDNA全長(zhǎng)2283 bp，編碼760個(gè)氨基酸，蛋白的理論分子量為86.488 kDa，等電點(diǎn)為6.47。同源性分析發(fā)現(xiàn)SjTβRⅡ基因氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)、多房棘球絳蟲(chóng)、紅原雞、黑猩猩、小鼠、斑胸草雀、人、斑馬魚(yú)等動(dòng)物TβRⅡ編碼基因推導(dǎo)的氨基酸序列一致性分別為70.7％、28.6％、18.4％、18.3％、18.1％、17.9％、17.9％、17.8％。此全長(zhǎng)cDNA序列已獲

10、得NCBI登錄號(hào)：FJ753578。
　　 （2）將SjTβRⅡ基因胞外段（SjTβRⅡout）克隆入原核表達(dá)載體pET28a(+)，通過(guò)雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-SjTβRⅡout在大腸桿菌BL21(DE3)中獲高效表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示重組蛋白分子量大小與預(yù)期完全一致。Western-blot結(jié)果表明該蛋白可分別被感染日本血吸蟲(chóng)和免疫重組蛋白的動(dòng)物血清所識(shí)別。

11、>　　 （3）免疫組織化學(xué)方法定位表明，SjTβRⅡ在成蟲(chóng)體壁和實(shí)質(zhì)細(xì)胞、蟲(chóng)卵內(nèi)毛蚴的實(shí)質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)。Realtime-PCR顯示SjTβRⅡ在日本血吸蟲(chóng)成蟲(chóng)、蟲(chóng)卵、尾蚴各期均特異轉(zhuǎn)錄，且其在蟲(chóng)卵和尾蚴中的轉(zhuǎn)錄水平高于其在成蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 （4）原核重組蛋白SjTβRⅡout免疫BALB/c小鼠后，進(jìn)行日本血吸蟲(chóng)尾蚴攻擊感染，檢測(cè)其免疫保護(hù)效果：與佐劑對(duì)照組（FCA）比較減蟲(chóng)率和減卵率分別為：20.62％、38.2

12、3％，SjGST免疫組的減蟲(chóng)率和減卵率分別為30.18％、45.70％，二者具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 （1）應(yīng)用RACE方法首次獲得SjTβRⅡ基因的全長(zhǎng)cDNA序列（2283 bp），其推導(dǎo)的氨基酸序列與曼氏血吸蟲(chóng)TβRⅡ氨基酸序列高度同源，與宿主人和小鼠TβRⅡ氨基酸序列同源性低。
　　 （2）成功構(gòu)建SjTβRⅡout原核重組表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，純化的重組蛋白具有