日本血吸蟲TβRII基因全長cDNA的克隆及其胞外段免疫保護功能的研究.pdf

1、日本血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種嚴重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，蟲卵沉積于肝、腸等組織中形成蟲卵肉芽腫及其纖維化是蟲體致病的最主要原因。目前，血吸蟲病疫苗的研制是血吸蟲病防治工作的重點之一。
　　 轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族成員在細胞的生長、分化、細胞外基質(zhì)的形成和免疫調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用[1-8]，且TGF-β1是目前公認的最強的肝

2、纖維化促進因子之一[9]。TGF-β在日本血吸蟲（Schistosoma japonicum，S.j）自身的生長發(fā)育過程中，以及在蟲體與宿主的相互作用中都發(fā)揮著重要作用[10]。TGF-β超家族包括一系列具有類似的結(jié)構(gòu)和功能的生長因子家族肽類。TβR（TGF-β受體）有多種，其中Ⅰ型（TβRⅠ）、Ⅱ型（TβRⅡ）、Ⅲ型（TβRⅢ）分布于多類細胞膜上。TβRⅠ和TβRⅡ在TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起主導(dǎo)作用，TβRⅡ具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，

3、在生理濃度下可單獨與TGF-β結(jié)合，結(jié)合后TβRⅡ胞內(nèi)段結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，再與TβRⅠ結(jié)合形成TGF-β-TβRⅡ-TβRⅠ復(fù)合體，隨之TβRⅠ胞內(nèi)段發(fā)生磷酸化，引起下游smad蛋白家族的一系列變化，從而將信號傳遞于細胞胞核內(nèi)[11,12]，調(diào)控目的基因表達。由此推測SjTβRⅡ在SjTGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中亦發(fā)揮著重要的樞紐作用。曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni S.m) TβRⅡ可通過激活TGF-β信號通路誘導(dǎo)抱雌溝蛋白

4、（Gynecophoral canal protein,GCP）表達，表明其在雄蟲促雌蟲發(fā)育成熟方面起著重要作用，提示TβRⅡ可作為疫苗候選分子。
　　 研究目的：
　　 鑒于SjTβRⅡ在蟲體TGF-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能發(fā)揮著重要的樞紐作用，以及作為疫苗候選分子的潛在性，本文擬用分子生物學(xué)等技術(shù)，獲得SjTβRⅡ全長cDNA，并對其編碼序列進行生物信息學(xué)分析；克隆和原核表達胞外段（SjTβRⅡout），且對表達產(chǎn)物進行免

5、疫活性檢測；將重組蛋白免疫動物，評價其免疫保護性效果；測定SjTβRⅡ在成蟲、蟲卵中的定位和轉(zhuǎn)錄水平。
　　 研究方法：
　　 （1）SjTβRⅡ基因全長cDNA序列由上海英濰捷基生物技術(shù)（Invitrogen）有限公司通過RACE方法擴增獲得。利用GeneBank，ExPASy等對該基因序列進行生物信息學(xué)分析，設(shè)計特異性引物，提取成蟲總RNA進行RT-PCR，對SjTβRⅡ基因全長編碼基因（ORF）進行特異性PCR擴增

6、、TA克隆。
　　 （2）特異擴增SjTβRⅡ基因胞外段（SjTβRⅡout），亞克隆至原核表達載體pET28a(+)，構(gòu)建pET28a(+)-SjTβRⅡout重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達，表達產(chǎn)物行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。純化重組蛋白并免疫大鼠制備抗血清，應(yīng)用Western Blotting方法初步鑒定重組蛋白。
　　 （3）用免疫組織化

7、學(xué)法檢測目的基因在蟲體中的定位；采用熒光定量PCR技術(shù)，對SjTβRⅡ基因在雌蟲、雄蟲、蟲卵、尾蚴的轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。
　　 （4）用SjTβRⅡout免疫小鼠，評價其動物免疫保護性效果。動物隨機分成3組:A組為SjTβRⅡout重組蛋白免疫組，B組為SjGST蛋白免疫組（陽性對照組），C組為佐劑對照組。以減蟲率和每克肝內(nèi)蟲卵減少率對目的基因動物免疫保護性效果進行評價。
　　 研究結(jié)果：
　　 （1）應(yīng)用RACE

8、方法獲得SjTβRⅡ基因的全長cDNA序列，所測序列長2867 bp，其ORF序列為2283bp，包括110 bp 5’UTR和474 bp 3’UTR（含有AATAAA和poly A等轉(zhuǎn)錄終止修飾點）。以成蟲總RNA為模板，應(yīng)用特異性引物經(jīng)RT-PCR擴增獲得約2300bp特異條帶，與預(yù)期分子量大小一致。將構(gòu)建的TA克隆重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定，出現(xiàn)與目的基因相符的條帶，同時測序結(jié)果表明該序列與Invitrogen公司應(yīng)用RACE方法獲得

9、的SjTβRⅡ基因cDNA序列完全一致。SjTβRⅡ基因cDNA全長2283 bp，編碼760個氨基酸，蛋白的理論分子量為86.488 kDa，等電點為6.47。同源性分析發(fā)現(xiàn)SjTβRⅡ基因氨基酸序列與曼氏血吸蟲、多房棘球絳蟲、紅原雞、黑猩猩、小鼠、斑胸草雀、人、斑馬魚等動物TβRⅡ編碼基因推導(dǎo)的氨基酸序列一致性分別為70.7％、28.6％、18.4％、18.3％、18.1％、17.9％、17.9％、17.8％。此全長cDNA序列已獲

10、得NCBI登錄號：FJ753578。
　　 （2）將SjTβRⅡ基因胞外段（SjTβRⅡout）克隆入原核表達載體pET28a(+)，通過雙酶切、PCR和測序鑒定，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。原核重組表達質(zhì)粒pET28a-SjTβRⅡout在大腸桿菌BL21(DE3)中獲高效表達。SDS-PAGE分析顯示重組蛋白分子量大小與預(yù)期完全一致。Western-blot結(jié)果表明該蛋白可分別被感染日本血吸蟲和免疫重組蛋白的動物血清所識別。

11、>　　 （3）免疫組織化學(xué)方法定位表明，SjTβRⅡ在成蟲體壁和實質(zhì)細胞、蟲卵內(nèi)毛蚴的實質(zhì)細胞中均有表達。Realtime-PCR顯示SjTβRⅡ在日本血吸蟲成蟲、蟲卵、尾蚴各期均特異轉(zhuǎn)錄，且其在蟲卵和尾蚴中的轉(zhuǎn)錄水平高于其在成蟲中的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 （4）原核重組蛋白SjTβRⅡout免疫BALB/c小鼠后，進行日本血吸蟲尾蚴攻擊感染，檢測其免疫保護效果：與佐劑對照組（FCA）比較減蟲率和減卵率分別為：20.62％、38.2

12、3％，SjGST免疫組的減蟲率和減卵率分別為30.18％、45.70％，二者具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 （1）應(yīng)用RACE方法首次獲得SjTβRⅡ基因的全長cDNA序列（2283 bp），其推導(dǎo)的氨基酸序列與曼氏血吸蟲TβRⅡ氨基酸序列高度同源，與宿主人和小鼠TβRⅡ氨基酸序列同源性低。
　　 （2）成功構(gòu)建SjTβRⅡout原核重組表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中獲得高效表達，純化的重組蛋白具有