三角帆蚌瘟病的病原病理及免疫相關(guān)因子篩選與表達(dá)分析.pdf

1、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是中國特有的最主要的淡水育珠蚌種。三角帆蚌瘟病是嚴(yán)重危害淡水珍珠生產(chǎn)的傳染性蚌病，該病傳染快、死亡率高、治療難度大；由于缺乏貝類免疫系統(tǒng)與免疫機(jī)制研究，且雙殼貝類的形態(tài)特點(diǎn)也給及時(shí)發(fā)現(xiàn)與防治疾病造成了諸多不便，因此，三角帆蚌瘟病常引發(fā)災(zāi)難性后果，受其影響，中國淡水珍珠產(chǎn)業(yè)幾度興衰。 20世紀(jì)80年代開始的三角帆蚌瘟病病原相關(guān)研究一直存在病毒與細(xì)菌兩類病原的報(bào)道。本研究以2005年9

2、月采集的三角帆蚌瘟病典型癥狀病蚌為基本材料，從病蚌組織的病毒分離提取、純化入手，在研究三角帆蚌瘟病病毒(Hyriopsis cumingiiplague virus，HcPV)的形態(tài)與分子結(jié)構(gòu)特征基礎(chǔ)上，系統(tǒng)探討了病毒復(fù)感健康三角帆蚌的組織病理變化特點(diǎn)；為探索三角帆蚌瘟病的抗病育種技術(shù)途徑與方法，應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression Subtractive Hybridization，SSH)，初步建立了三角帆蚌肝臟cDNA文

3、庫，篩選分析三角帆蚌瘟病的免疫相關(guān)因子。論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1．HcPV的形態(tài)與分子結(jié)構(gòu)特征 對典型癥狀的頻死病蚌組織進(jìn)行滅菌處理后，經(jīng)差速、蔗糖密度梯度離心，負(fù)染，電鏡下觀察到大量病毒粒子，其形態(tài)為圓形或橢圓形，直徑20-310nm，無囊膜包裹，表面布滿纖突；病毒經(jīng)三次傳代復(fù)感后，實(shí)驗(yàn)致病死亡率仍然達(dá)90％以上，病毒粒子主要沉積在30％-50％蔗糖密度條帶；在有明顯病理癥狀的三角帆蚌組織的電鏡超薄切片可清晰

4、見到病毒顆粒。這些病毒形態(tài)可區(qū)別于前人報(bào)道的HcPV。 收集差速離心提取的病毒，經(jīng)分子生物學(xué)手段鑒定，可知病毒為3節(jié)段、雙鏈RNA型病毒；病毒分子量0.2-3.0kb。以病毒RNA為模板，用隨機(jī)六聚體引物擴(kuò)增構(gòu)建該病毒的cDNA文庫，隨機(jī)挑選45個(gè)克隆進(jìn)行測序，在得到的38個(gè)有效序列中，首次發(fā)現(xiàn)有5個(gè)陽性克隆序列(E值>-6)未見接近的同源序列；推測所得的5個(gè)序列可能是HcPV的新基因序列片段。 2．三角帆蚌瘟病的組織病

5、理變化特點(diǎn) 光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡分別觀察三角帆蚌瘟病病理組織，可相互彌補(bǔ)各自觀察視野的局限性。本研究按攻毒后3、5、7、9、11天不同時(shí)間各組織的病理變化進(jìn)行了制片觀察，電鏡結(jié)果表明，病毒對蚌組織結(jié)構(gòu)的主要影響是：細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器腫脹變形，嚴(yán)重時(shí)膜結(jié)構(gòu)斷裂溶解，最后形成空泡；光學(xué)顯微鏡下主要表現(xiàn)為各組織上皮細(xì)胞腫大變形，排列不整齊，甚至脫落溶解，嗜堿性增強(qiáng)，黏液細(xì)胞增多，結(jié)締組織細(xì)胞和肌纖維破裂溶解，最終形成空白

6、區(qū)域。從各組織的病理變化程度來看，病毒在肝臟、胃和中腸中增殖最快，產(chǎn)生影響的時(shí)間最短，對組織的破壞也最嚴(yán)重，其次是外套膜，對鰓和斧足也有一定的破壞作用。 3．三角帆蚌肝臟消減cDNA文庫構(gòu)建及其序列分析 采用抑制性消減雜交技術(shù)，構(gòu)建了健康三角帆蚌和抗病三角帆蚌(攻毒后健康存活者)肝臟的消減cDNA文庫，隨機(jī)挑取107個(gè)cDNA克隆進(jìn)行了單向測序，共獲得有效cDNA序列87個(gè)。 序列同源性搜索結(jié)果顯示，在87個(gè)有效

7、cDNA序列中，有58個(gè)克隆和GenBank中的已知功能的序列具有較高的同原性(E值<-6)；4個(gè)則與未知功能的開放閱讀框具有較高的相似性，稱之為假定蛋白；1個(gè)序列則沒有任何相似的序列，很有可能是以前沒有鑒定過的EST序列或是5’-或3’-UTR序列。82個(gè)已知功能的EST分別屬于23個(gè)不同的基因，均為三角帆蚌的首次報(bào)道。 根據(jù)Adams對功能基因的分類方法，所獲得EST分為8類：細(xì)胞分裂相關(guān)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)與運(yùn)動(dòng)相關(guān)、代謝相關(guān)、信號

8、傳導(dǎo)相關(guān)、細(xì)胞防疫相關(guān)、基因與蛋白表達(dá)相關(guān)(含轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)翻譯后的加工)、其它功能蛋白和未知功能蛋白等。其中細(xì)胞防御、代謝和功能蛋白表達(dá)等免疫相關(guān)因子序列的克隆數(shù)達(dá)46個(gè)，占總克隆數(shù)的52.87％。 4．三角帆蚌類：PIT54序列分析與組織特異性表達(dá) 利用Clustal W，1.83軟件，預(yù)測了三角帆蚌類PIT 54(EX828677)的氨基酸翻譯序列，通過三角帆蚌、紅原雞、草魚、家鼠、牛、豬、人等

9、進(jìn)化階層代表生物的PIT 54或HP的氨基酸序列比對得知：三角帆蚌類PIT 54的預(yù)測氨基酸序列與紅原雞PIT 54的氨基酸序列相似性最高，為35.04％；其余依次為人13.87％，草魚13.56％，家鼠13.14％，牛11.68％，豬11.68％。利用MEGA4.0軟件構(gòu)建的基因進(jìn)化系統(tǒng)樹證實(shí)了該基因與物種進(jìn)化相一致的發(fā)育進(jìn)程。 三角帆蚌類PIT 54基因在不同組織間表達(dá)的半定量RT-PCR結(jié)果表明，在心、肝臟、腸、外套膜、鰓