膠質細胞在帕金森病中的雙重作用——蛋白質組學研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson'sdisease，PD)是一種中老年人常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，病理上主要表現(xiàn)為黑質多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元的丟失死亡及路易小體形成。目前，對于膠質細胞對DA能神經(jīng)元的雙重作用的具體機制尚有待于進一步闡明。本研究利用蛋白質組學技術的優(yōu)勢，采用SILAC、DIGE、生物質譜等多種先進的蛋白質組學方法，對與膠質細胞對DA能神經(jīng)元雙重作用相關的蛋白進行了較大規(guī)模的篩選。并進一步結合功能學方法，對蛋白

2、質組學的結果進行了分析和驗證。 本課題共分為兩個部分：(一)對于膠質細胞毒性作用的研究：主要關注小膠質細胞在致炎因子脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激早期的反應。(二)對于膠質細胞保護性作用的研究：主要關注膠質細胞所釋放GDNF可能的下游信號分子。 第一部分：蛋白質組學研究揭示小膠質細胞在炎性刺激早期大量分泌溶酶體相關蛋白 LPS是一種強大的致炎因子、小膠質細胞激活劑，被廣泛應用于研究小膠

3、質細胞在帕金森病等神經(jīng)變性性疾病中的作用。由于對于在致炎因素作用下小膠質細胞的早期反應目前仍然知之甚少。因此，本研究致力于用蛋白質組學的方法揭示膠質細胞在LPS炎性刺激早期分泌蛋白的特征性變化。 1.蛋白質組學研究：小膠質細胞在脂多糖(LPS)刺激早期分泌蛋白的差異表達(1)取SpragueDawley大鼠全腦進行小膠質細胞原代培養(yǎng)及純化，純度＞98％；(2)利用WesemBlot及ELISA的方法檢測了小膠質細胞在LPS刺激下

4、表達誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、前列腺素E2(PGE2)及其合成酶環(huán)氧化酶.2(COX-2)的時間效應關系，顯示iNOS在LPS刺激后3小時表達，PGE2和COX-2在LPS刺激后24小時表達明顯。(3)選擇LPS刺激1小時為時間點，利用SILAC方法在細胞培養(yǎng)階段對蛋白進行同位素標記，質譜液相色譜-電噴霧-串聯(lián)質譜進行蛋白的鑒定及定量比較LPS刺激組和正常對照組兩組細胞培養(yǎng)基中分泌蛋白表達的差異。共有155個蛋白被成功鑒定。(4)

5、利用生物信息學分析軟件SignalP以及GenomeOntology數(shù)據(jù)庫檢索對所鑒定蛋白進行亞細胞定位及生物學功能分類。結果顯示，有77個蛋白符合分泌蛋白標準，其中，28個蛋白與溶酶體相關，13個溶酶體相關的蛋白的分泌水平在LPS刺激下發(fā)生了明顯的變化。 2.功能學研究：LPS刺激下小膠質細胞大量釋放的溶酶體相關蛋白對多巴胺能神經(jīng)元的毒性作用(1)利用WesternBlot的方法對蛋白質組學的結果進行驗證，均與蛋白質組學結果相

6、吻合。(2)利用共聚焦的方法觀察了cathepsinL與溶酶體標志蛋白LAMP-1的共定位情況，這兩種蛋白在胞漿中的分布是共定位的，說明在分泌蛋白中所檢測到的cathepsinL的確來源于小膠質細胞溶酶體。(3)利用ELISA的方法檢測了溶菌酶(lysozyme)的活力，相對于對照組而言經(jīng)LPS處理1小時的小膠質細胞培養(yǎng)基中，該酶活力明顯上升。(4)檢測了小膠質細胞培養(yǎng)條件下20Schyrnotrypsin蛋白酶和postglutamy

7、l蛋白酶的活力，此兩種酶的活力在LPS處理的情況下相對于對照組，均未發(fā)生明顯改變。(5)檢測MES23.5細胞酪氨酸羥化酶蛋白豐度及多巴胺攝取能力，反映條件培養(yǎng)基作用下DA能神經(jīng)元的功能。結果顯示LPS刺激早期的小膠質細胞培養(yǎng)基對DA能神經(jīng)元有毒性作用，溶酶體抑制劑NH4Cl可以明顯抑制該神經(jīng)毒性。 結論：小膠質細胞在LPS刺激早期大量釋放溶酶體相關蛋白，這些蛋白的早期釋放參與了小膠質細胞對DA能神經(jīng)元的毒性作用。因此，本研究篩

8、選出大量與小膠質細胞炎癥反應相關的蛋白，從而為下一步PD發(fā)病機制探索及臨床藥物篩選提供了線索；除此之外，本研究從全新的視角提出了小膠質細胞參與PD等神經(jīng)變性性疾病發(fā)生過程的可能機制。 第二部分：磷酸化修飾的蛋白質組學研究揭示膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)下游信號分子 GNDF是由膠質細胞分泌的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，被認為是膠質細胞對神經(jīng)元發(fā)揮保護作用最主要的途徑。它對DA能神經(jīng)元的神經(jīng)保護及促生長作用尤其明顯，被認為是

9、神經(jīng)保護治療PD的首選神經(jīng)營養(yǎng)因子。然而對于GDNF信號轉導的具體機制尚不完全清楚，因此，本研究致力于用蛋白質組學的方法尋找參與GDNF信號轉導通路的可能的信號分子。 1.蛋白質組學研究：PC12細胞在GDNF刺激下發(fā)生調(diào)變的磷酸化蛋白譜(1)觀察GDNF所引發(fā)的雙轉GFRαl和RET的PC12細胞軸突生長作用，200ng/mlGDNF刺激12小時以內(nèi)，無明顯的軸突生長；(2)取GDNF處理0.5小時和10小時作為時間點，利用D

10、IGE方法對所純化的磷酸化蛋白進行標記，雙向電泳-串聯(lián)質譜進行蛋白的鑒定及定量比較GDNF刺激組和正常對照組兩組細胞磷酸化蛋白表達的差異，串聯(lián)質譜進行差異蛋白的鑒定。125差異點中，共有92個點被成功鑒定。(3)利用生物信息學分析軟件Cluster和Treeview對所獲得差異蛋白進行叢集性分析，用生物信息學GenomeOntology數(shù)據(jù)庫檢索對所鑒定蛋白進行亞細胞定位及生物學功能分類。結果顯示，共有75個點的蛋白在GDNF處理的兩個

11、時間點上均發(fā)生了上調(diào)(鑒定出來58個點，代表47個基因)，大部分蛋白(74.1％)具有“捆綁”(binding)的功能，部分蛋白具有水解酶活力(20.4％)。 2.功能學研究：小熱休克蛋白27(hsp27)的磷酸化參與GDNF引起的軸突生長(1)利甩WesternBlot及RT-PCR的方法對蛋白質組學的結果進行驗證，結果顯示，在GDNF刺激下，PC12雙轉細胞的Hsp27總蛋白表達水平不變，磷酸化蛋白水平有所上調(diào)，與蛋白質組學

12、結果一致；(2)利用共聚焦顯微鏡技術及WesternBlot觀察，在GDNF刺激下，Hsp27迅速發(fā)生核內(nèi)轉位，24小時復位至胞漿，此過程伴隨著核內(nèi)磷酸化Hsp27的明顯上調(diào)。(3)構建了聯(lián)合表達綠色熒光蛋白GFP的RNAi干擾質粒，對PC12雙轉細胞的Hsp27成功干擾后，GDNF引起的軸突生長作用明顯受到抑制。(4)構建了聯(lián)合表達綠色熒光蛋白GFP的野生型及特異性磷酸化位點定點突變的Hsp27質粒，結果表明，顯性負向突變可使GDNF