Bardet-BiedL綜合征蛋白質(zhì)復(fù)合體BBSome在蛋白-蛋白相互作用調(diào)節(jié)及分子伴侶復(fù)合輔助下的組裝.pdf

1、目的：
　　 纖毛(cilium/cilia)是從一些原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表面伸出的突起，由三個(gè)主要部分組成:中央軸絲、圍繞它的質(zhì)膜和一些細(xì)胞質(zhì)。纖毛在脊椎動(dòng)物體內(nèi)的廣泛存在可以解釋當(dāng)其結(jié)構(gòu)或功能出現(xiàn)障礙時(shí)出現(xiàn)的復(fù)雜多樣的疾病或表型。目前已知存在纖毛功能不全的有腎、視網(wǎng)膜組織以及神經(jīng)管、發(fā)育中的肢體、胰腺、肝臟、脾、骨骼及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一些部分。這些疾病因病因?qū)W及遺傳學(xué)方面的重疊而被歸入一個(gè)大類，統(tǒng)稱為纖毛相關(guān)疾病(Ciliopa

2、thies)。日前的研究數(shù)據(jù)可幫助我們?cè)谶@類疾病中發(fā)現(xiàn)新的基因突變，另外在認(rèn)識(shí)纖毛相關(guān)疾病的癥狀方面也大有幫助。
　　 Bardet-Biedl綜合征（Bardet-Biedl syndrome，BBS）是一種罕見(jiàn)的與纖毛相關(guān)的人類常染色體隱性遺傳疾病，影響人體多個(gè)系統(tǒng)。其主要臨床癥狀包括肥胖、視網(wǎng)膜色素變性、多指（趾）畸形、多囊腎、性腺發(fā)育不全、認(rèn)知障礙、高血壓及糖尿病等等。由于其多樣的臨床癥狀，使Bardet-Biedl綜合

3、征成為研究多種人類疾病分子機(jī)制的重要模型。到日前為止，共有16個(gè)BBS基因被報(bào)導(dǎo)，其中BBS1、2、4、5、7、8和9七種所編碼的蛋白共同構(gòu)成Bardet-Biedl綜合征蛋白復(fù)合體BBSome。
　　 人們對(duì)BBSome組裝過(guò)程的步驟、調(diào)節(jié)知之甚少。在體內(nèi)，幾乎所有的構(gòu)成BBSome的蛋白都以BBSome復(fù)合體亞基形式存在，而極少見(jiàn)游離分子，這提示BBSome的組裝過(guò)程進(jìn)行的非常迅速，且各中間體存在時(shí)間極短。本研究對(duì)BBSom

4、e復(fù)合體組裝的全過(guò)程進(jìn)行了深入研究，嘗試建立一個(gè)BBSome組裝的模型。對(duì)BBSome組裝過(guò)程的研究將給各亞基的功能研究奠定基礎(chǔ)，并給BBSome的整體功能研究提供新的思路。
　　 材料及方法：
　　 1、克隆及亞克隆使用的菌株、載體、工具酶等
　　 大腸桿菌DH5α，克隆載體PSTBlue、 StrataClone，表達(dá)載體pCS2(+)-3xFlag、pCS2(+)-HA、 pCS2(+)-mycs、 pEG

5、FP-N3/C3; Expand HiFi、Expand Long TemplateDNA合成酶;所有限制性內(nèi)切酶（包括部分高保真版本）、T4 DNA連接酶、Klenow等來(lái)自NEB。所有點(diǎn)突變型質(zhì)粒均使用QuickChangeⅡ site-directedmutagenesis試劑盒構(gòu)建并經(jīng)測(cè)序確認(rèn)。所有相關(guān)人類及小鼠基因cDNA序列信息來(lái)自UCSC Genome Browser數(shù)據(jù)庫(kù)，使用APE共享版軟件及Sequencher4.8

6、進(jìn)行序列分析、內(nèi)切酶選擇、引物設(shè)計(jì)及測(cè)序結(jié)果對(duì)比篩選。
　　 2、本研究中應(yīng)用的抗體
　　 兔抗人多克隆抗體BBS1、2、4、7，單克隆抗體anti-β-tubulin，多克隆抗體anti-β-actin，單克隆抗體anti-acetylated tubulin，單克隆抗體anti-γ-tubulin，兔抗人單克隆抗體anti-BBS8、9， thermolysin， and cycloheximide。羊anti-BB

7、S2(C-16)。大鼠anti-TCP1a and TCP1b。兔anti-ubiquitin。 Smartpool RNAi against humanBBS2, BBS10, BBS12, BBS9。
　　 3、細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
　　 本研究使用的皮膚成纖維細(xì)胞取自(一)攜帶BBS10常見(jiàn)突變c91fs95的人類Bardet-Biedl綜合征患者;另使用293T細(xì)胞及hTERT-RPE1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染使用lipofecta

8、mine2000或RNAiMAX。
　　 4、免疫熒光觀察目的蛋白定位
　　 細(xì)胞以冷甲醇與固定后PBS洗滌封閉;封閉液中稀釋日的蛋白標(biāo)簽—抗在窒溫孵育后PBS洗滌;再次封閉，后以Alexa488或Alexa568標(biāo)記的二抗孵育。最終以Vectashield mounting media containing DAPI裱片，并在熒光共焦顯微鏡下觀察并拍攝。
　　 5、免疫共沉淀觀察各蛋白質(zhì)分子間相互作用
　

9、　 使用不同標(biāo)簽的人類BBS基因被共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，裂解細(xì)胞、離心。取上清以protein G beads孵育。經(jīng)孵育后的細(xì)胞裂解液再以標(biāo)記有相應(yīng)抗體的beads孵育，以裂解液洗滌后行Western Blot并以相應(yīng)抗體檢測(cè)。
　　 6、Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平
　　 取野生型及突變型雄性小鼠睪丸制備組織勻漿，Nanodrop蛋白定量。蛋白經(jīng)電泳分離、電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素并以SuperS

10、ignal Dura extended substrate發(fā)光檢測(cè)。
　　 7、蔗糖密度梯度離心
　　 小鼠組織制備組織勻漿，離心，上清轉(zhuǎn)移至20-60％蔗糖梯度離心液，超速離心。取上清液并以冷丙酮沉淀，離心。沉淀以SDS-PAGE上樣緩沖液溶解并以Western Blot檢測(cè)。
　　 8、蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)觀察蛋白質(zhì)穩(wěn)定性及降解情況
　　 以分析液裂解細(xì)胞，等量蛋白與therolysin混合。終止反應(yīng)后W

11、estern Blot檢測(cè)，觀察泛素化蛋白質(zhì)降解途徑下BBS蛋白的降解情況。
　　 9、小鼠
　　 本研究中應(yīng)用了多個(gè)Bbs基因knock-in或knock-out小鼠。
　　 結(jié)果：
　　 1、BBS2、7、9首先形成一個(gè)三元亞復(fù)合體
　　 BBS2、7、9之間存在較強(qiáng)的相互作用，這種作用強(qiáng)于這三種蛋白與其他BBSome組分蛋白。該三元亞復(fù)合體成為整個(gè)BBSome的核心及其他亞基蛋白組裝進(jìn)入BB

12、Some的平臺(tái)。
　　 2、BBS1及BBS4最后裝配入BBSome
　　 BBS1的最常見(jiàn)錯(cuò)意突變型蛋白M390R并不影響除BBS4之外BBSome其他亞基組裝進(jìn)入復(fù)合體，所有BBSome亞基蛋白中BBS1及BBS4最后裝配入BBSome，BBS4的整合則依賴于BBS1的存在。
　　 3、BBS4的定位
　　 BBS4與PCM1的結(jié)合及定位于中心體/中心粒周圍衛(wèi)星體的過(guò)程不依賴于BBSome其它亞基，說(shuō)

13、明這一定位是BBS4分子的固有屬性。
　　 4、BBS10的調(diào)節(jié)作用
　　 BBS10調(diào)節(jié)BBS7/12/6亞復(fù)合物及CCT/TRiC復(fù)合體之間的相互作用，且在整個(gè)BBSome的組裝過(guò)程和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。
　　 5、BBS7的釋放
　　 BBS7從BBS分子伴侶復(fù)合體中釋放后參與形成BBS7/2/9的三元亞復(fù)合物。BBS9整合入BBSome是與CCT/TRiC復(fù)合體脫離BBS2/BBS7的過(guò)程相藕

14、連的。
　　 6、BBS2的穩(wěn)定性
　　 BBS2的穩(wěn)定性依賴于BBS2/BBS7/BBS9亞復(fù)合物、分子伴侶BBS蛋白及CCT/TRiC復(fù)合體。游離狀態(tài)下的BBS2最終進(jìn)入泛素化途徑被蛋白酶體降解。
　　 結(jié)論：
　　 BBS2、7、9首先在BBS分子伴侶復(fù)合體的輔助下形成BBSome的核心三元復(fù)合體，而后BBSome的其他組分蛋白BBS1、5、8分別獨(dú)立整合入BBSome，最后BBS4依賴于BBS1的