喹噁啉類(lèi)對(duì)大腸桿菌DNA損傷的機(jī)制研究.pdf

1、喹噁啉類(lèi)化合物(Quinoxalines)為人工合成的一類(lèi)抗菌藥，均屬喹噁啉-1，4-二氧化物的衍生物，主要代表藥物有卡巴氧(Carbadox，CBX)、喹乙醇(Olaquindox，OLA)、乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)、喹烯酮(Quinocetone，QCT)和喹賽多(Cyadox，CYA)。其中前四種為20世紀(jì)合成的化合物，喹賽多為后來(lái)研發(fā)的喹噁啉類(lèi)新品種，具有抗菌促生長(zhǎng)作用顯著、毒副作用低、使用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)

2、注。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)喹賽多的體外抑菌試驗(yàn)和抗菌機(jī)理的研究，表明喹賽多具有較強(qiáng)的抑菌作用和與喹噁啉類(lèi)的其他藥物一樣具有相似的損傷細(xì)菌DNA的作用。但是關(guān)于喹噁啉類(lèi)化合物損傷DNA的明確的抗菌作用機(jī)制至今未得到很好的揭示。本課題選取喹噁啉類(lèi)中的喹賽多和喹乙醇為代表，及對(duì)其敏感的大腸桿菌為研究對(duì)象，從喹賽多和喹乙醇對(duì)DNA的直接作用和對(duì)DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶兩方面進(jìn)行藥物作用機(jī)理的研究。菌體內(nèi)外觀察藥物對(duì)DNA直接作用的損傷情況，并選取與DN

3、A合成和修復(fù)過(guò)程有關(guān)的一些關(guān)鍵酶:E.coli DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、E.coli DNA旋轉(zhuǎn)酶、E.coli DNA聚合酶和E.coli DNA連接酶為研究對(duì)象，體外借助凝膠電泳檢測(cè)和熒光檢測(cè)技術(shù)考察喹噁啉類(lèi)對(duì)細(xì)菌DNA損傷的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　1.喹噁啉類(lèi)藥物MIC和MBC的測(cè)定
　　本實(shí)驗(yàn)選用雞源大腸桿菌CVCC2943，分別在厭氧和有氧條件下檢測(cè)該菌株對(duì)喹賽多、喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹的敏感性。實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法檢

4、測(cè)藥物對(duì)大腸桿菌CVCC2943的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果測(cè)得喹賽多在厭氧條件下的MIC值為1μg/mL，MBC值為4μg/mL，有氧條件下MIC值為16μg/mL，MBC值為128μg/mL;喹乙醇在厭氧條件下MIC值為4μg/mL，MBC值為16μg/mL，有氧條件下MIC值為16μg/mL，MBC值為128μg/mL;卡巴氧在厭氧條件下MIC值為0.25μg/mL，MBC值為1μg/mL，有氧條件下M

5、IC值為2μg/mL;乙酰甲喹在厭氧條件下MIC值為0.5μg/mL，MBC值為2μg/mL，有氧條件下MIC值為2μg/mL，MBC值為16μg/mL。從結(jié)果中可看出喹賽多和喹噁啉類(lèi)的其他藥物一樣具有很好的厭氧選擇活性。由于喹賽多低毒、低殘留的特點(diǎn)，并且為新研發(fā)的喹噁啉類(lèi)藥物，喹乙醇為已有的喹噁啉類(lèi)藥物，其抗菌作用的具體機(jī)理的研究也沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對(duì)喹乙醇的已有研究，所以本課題選擇喹賽多和喹乙醇為代表來(lái)研究喹噁啉類(lèi)致細(xì)菌DN

6、A損傷的機(jī)制。
　　2.喹賽多和喹乙醇對(duì)DNA損傷的直接作用研究
　　以往對(duì)喹噁啉類(lèi)抗菌作用機(jī)制的研究多采用同位素標(biāo)記和電子顯微鏡觀察核酸的變化，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠電泳檢測(cè)DNA的損傷，分為藥物體外對(duì)pBR322質(zhì)粒DNA的作用和將藥物與細(xì)菌一起孵育后提取質(zhì)粒DNA，觀察藥物對(duì)DNA的損傷情況。體外分為有氧和厭氧兩種條件，厭氧條件下又分為將藥物直接與DNA作用和藥物在黃嘌呤氧化酶的代謝下與DNA作用。結(jié)果表明無(wú)論在有氧還是厭氧下

7、，藥物不經(jīng)黃嘌呤氧化酶代謝均不能使DNA發(fā)生斷裂。厭氧下喹賽多和喹乙醇經(jīng)黃嘌呤氧化酶還原可使DNA發(fā)生明顯的斷裂，使DNA發(fā)生明顯斷裂的終濃度均為8μg/mL，當(dāng)共同孵育30min時(shí)，DNA有輕微的斷裂，孵育1小時(shí)后，DNA就有明顯的損傷。體外檢測(cè)說(shuō)明喹賽多和喹乙醇經(jīng)代謝后可直接損傷DNA。體內(nèi)首先將質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)入到細(xì)菌中，再與藥物一起孵育后提取質(zhì)粒DNA，結(jié)果揭示當(dāng)喹賽多濃度為4μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)菌體內(nèi)的質(zhì)粒DNA有輕微的降解，

8、隨著藥物濃度的增加，降解的程度增強(qiáng)，當(dāng)喹賽多濃度為16μg/mL時(shí)，菌體質(zhì)粒DNA發(fā)生明顯的降解。而喹乙醇作用組當(dāng)濃度為32μg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)菌體內(nèi)的質(zhì)粒DNA有輕微的降解，并且隨著喹乙醇濃度的增加，質(zhì)粒DNA損傷的程度并無(wú)太大的變化。
　　3.喹賽多和喹乙醇對(duì)DNA合成和修復(fù)酶的影響
　　實(shí)驗(yàn)分別采用凝膠電泳檢測(cè)和熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化來(lái)檢測(cè)喹賽多和喹乙醇兩種藥物對(duì)E.coli DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、旋轉(zhuǎn)酶、聚合酶和連接酶活性的

9、影響。前兩種酶通過(guò)它們各自對(duì)超螺旋DNA的解旋作用來(lái)作為酶活性的檢測(cè)指標(biāo)，后兩種酶通過(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度的變化計(jì)算各自的反應(yīng)初速度這一動(dòng)力學(xué)參數(shù)來(lái)作為它們的活性指標(biāo)。對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶和旋轉(zhuǎn)酶的檢測(cè)以超螺旋pBR322 DNA為研究對(duì)象，結(jié)果顯示無(wú)論是藥物直接與兩種酶反應(yīng)還是藥物在代謝酶的作用下與兩種酶反應(yīng)，兩種酶均不能對(duì)各自的底物DNA進(jìn)行解旋，說(shuō)明喹賽多和喹乙醇對(duì)E.coli DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和旋轉(zhuǎn)酶的活性沒(méi)有抑制作用，藥物并不是通過(guò)抑制兩種酶

10、的活性來(lái)阻礙DNA的合成。對(duì)E.coli DNA聚合酶和連接酶活性的檢測(cè)是通過(guò)反應(yīng)初速度的變化來(lái)判斷，結(jié)果表明喹賽多和喹乙醇無(wú)論是直接與DNA聚合酶反應(yīng)還是在代謝后與該酶反應(yīng)，聚合酶催化的DNA聚合反應(yīng)的初速度有明顯的下降，說(shuō)明藥物對(duì)聚合酶的活性有明顯的抑制作用，并且隨藥物濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，藥物作用30min便可產(chǎn)生抑制。脫一氧喹賽多和脫二氧喹賽多對(duì)聚合酶活性的影響，結(jié)果顯示當(dāng)在N1位脫去氧原子時(shí)，聚合酶催化的聚合反應(yīng)初速度有明顯

11、的下降，但當(dāng)N4位脫去氧原子或N1位和N4位均脫氧時(shí)，聚合酶催化的聚合反應(yīng)初速度無(wú)明顯變化。說(shuō)明N1脫一氧喹賽多也可抑制聚合酶的活性。兩種藥物直接與連接酶反應(yīng)后可對(duì)該酶催化的DNA連接反應(yīng)的初速度產(chǎn)生一定的下降作用，但當(dāng)藥物代謝后對(duì)該酶催化的連接反應(yīng)的初速度無(wú)明顯變化，說(shuō)明藥物原型也可對(duì)連接酶的活性產(chǎn)生抑制。
　　由此可得出喹賽多和喹乙醇在黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶還原體系下經(jīng)還原代謝直接損傷DNA。喹賽多和喹乙醇對(duì)DNA損傷的另一途徑