喹噁啉類對大腸桿菌DNA損傷的機(jī)制研究.pdf

1、喹噁啉類化合物(Quinoxalines)為人工合成的一類抗菌藥，均屬喹噁啉-1，4-二氧化物的衍生物，主要代表藥物有卡巴氧(Carbadox，CBX)、喹乙醇(Olaquindox，OLA)、乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)、喹烯酮(Quinocetone，QCT)和喹賽多(Cyadox，CYA)。其中前四種為20世紀(jì)合成的化合物，喹賽多為后來研發(fā)的喹噁啉類新品種，具有抗菌促生長作用顯著、毒副作用低、使用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)

2、注。本實(shí)驗(yàn)室通過對喹賽多的體外抑菌試驗(yàn)和抗菌機(jī)理的研究，表明喹賽多具有較強(qiáng)的抑菌作用和與喹噁啉類的其他藥物一樣具有相似的損傷細(xì)菌DNA的作用。但是關(guān)于喹噁啉類化合物損傷DNA的明確的抗菌作用機(jī)制至今未得到很好的揭示。本課題選取喹噁啉類中的喹賽多和喹乙醇為代表，及對其敏感的大腸桿菌為研究對象，從喹賽多和喹乙醇對DNA的直接作用和對DNA合成和修復(fù)有關(guān)的酶兩方面進(jìn)行藥物作用機(jī)理的研究。菌體內(nèi)外觀察藥物對DNA直接作用的損傷情況，并選取與DN

3、A合成和修復(fù)過程有關(guān)的一些關(guān)鍵酶:E.coli DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、E.coli DNA旋轉(zhuǎn)酶、E.coli DNA聚合酶和E.coli DNA連接酶為研究對象，體外借助凝膠電泳檢測和熒光檢測技術(shù)考察喹噁啉類對細(xì)菌DNA損傷的機(jī)制進(jìn)行研究。
　　1.喹噁啉類藥物MIC和MBC的測定
　　本實(shí)驗(yàn)選用雞源大腸桿菌CVCC2943，分別在厭氧和有氧條件下檢測該菌株對喹賽多、喹乙醇、卡巴氧、乙酰甲喹的敏感性。實(shí)驗(yàn)采用微量肉湯稀釋法檢

4、測藥物對大腸桿菌CVCC2943的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)。結(jié)果測得喹賽多在厭氧條件下的MIC值為1μg/mL，MBC值為4μg/mL，有氧條件下MIC值為16μg/mL，MBC值為128μg/mL;喹乙醇在厭氧條件下MIC值為4μg/mL，MBC值為16μg/mL，有氧條件下MIC值為16μg/mL，MBC值為128μg/mL;卡巴氧在厭氧條件下MIC值為0.25μg/mL，MBC值為1μg/mL，有氧條件下M

5、IC值為2μg/mL;乙酰甲喹在厭氧條件下MIC值為0.5μg/mL，MBC值為2μg/mL，有氧條件下MIC值為2μg/mL，MBC值為16μg/mL。從結(jié)果中可看出喹賽多和喹噁啉類的其他藥物一樣具有很好的厭氧選擇活性。由于喹賽多低毒、低殘留的特點(diǎn)，并且為新研發(fā)的喹噁啉類藥物，喹乙醇為已有的喹噁啉類藥物，其抗菌作用的具體機(jī)理的研究也沒有相關(guān)報道，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室對喹乙醇的已有研究，所以本課題選擇喹賽多和喹乙醇為代表來研究喹噁啉類致細(xì)菌DN

6、A損傷的機(jī)制。
　　2.喹賽多和喹乙醇對DNA損傷的直接作用研究
　　以往對喹噁啉類抗菌作用機(jī)制的研究多采用同位素標(biāo)記和電子顯微鏡觀察核酸的變化，本實(shí)驗(yàn)采用凝膠電泳檢測DNA的損傷，分為藥物體外對pBR322質(zhì)粒DNA的作用和將藥物與細(xì)菌一起孵育后提取質(zhì)粒DNA，觀察藥物對DNA的損傷情況。體外分為有氧和厭氧兩種條件，厭氧條件下又分為將藥物直接與DNA作用和藥物在黃嘌呤氧化酶的代謝下與DNA作用。結(jié)果表明無論在有氧還是厭氧下

7、，藥物不經(jīng)黃嘌呤氧化酶代謝均不能使DNA發(fā)生斷裂。厭氧下喹賽多和喹乙醇經(jīng)黃嘌呤氧化酶還原可使DNA發(fā)生明顯的斷裂，使DNA發(fā)生明顯斷裂的終濃度均為8μg/mL，當(dāng)共同孵育30min時，DNA有輕微的斷裂，孵育1小時后，DNA就有明顯的損傷。體外檢測說明喹賽多和喹乙醇經(jīng)代謝后可直接損傷DNA。體內(nèi)首先將質(zhì)粒pBR322轉(zhuǎn)入到細(xì)菌中，再與藥物一起孵育后提取質(zhì)粒DNA，結(jié)果揭示當(dāng)喹賽多濃度為4μg/mL時，對細(xì)菌體內(nèi)的質(zhì)粒DNA有輕微的降解，

8、隨著藥物濃度的增加，降解的程度增強(qiáng)，當(dāng)喹賽多濃度為16μg/mL時，菌體質(zhì)粒DNA發(fā)生明顯的降解。而喹乙醇作用組當(dāng)濃度為32μg/mL時，對細(xì)菌體內(nèi)的質(zhì)粒DNA有輕微的降解，并且隨著喹乙醇濃度的增加，質(zhì)粒DNA損傷的程度并無太大的變化。
　　3.喹賽多和喹乙醇對DNA合成和修復(fù)酶的影響
　　實(shí)驗(yàn)分別采用凝膠電泳檢測和熒光信號強(qiáng)度的變化來檢測喹賽多和喹乙醇兩種藥物對E.coli DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、旋轉(zhuǎn)酶、聚合酶和連接酶活性的

9、影響。前兩種酶通過它們各自對超螺旋DNA的解旋作用來作為酶活性的檢測指標(biāo)，后兩種酶通過對熒光強(qiáng)度的變化計算各自的反應(yīng)初速度這一動力學(xué)參數(shù)來作為它們的活性指標(biāo)。對拓?fù)洚悩?gòu)酶和旋轉(zhuǎn)酶的檢測以超螺旋pBR322 DNA為研究對象，結(jié)果顯示無論是藥物直接與兩種酶反應(yīng)還是藥物在代謝酶的作用下與兩種酶反應(yīng)，兩種酶均不能對各自的底物DNA進(jìn)行解旋，說明喹賽多和喹乙醇對E.coli DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和旋轉(zhuǎn)酶的活性沒有抑制作用，藥物并不是通過抑制兩種酶

10、的活性來阻礙DNA的合成。對E.coli DNA聚合酶和連接酶活性的檢測是通過反應(yīng)初速度的變化來判斷，結(jié)果表明喹賽多和喹乙醇無論是直接與DNA聚合酶反應(yīng)還是在代謝后與該酶反應(yīng)，聚合酶催化的DNA聚合反應(yīng)的初速度有明顯的下降，說明藥物對聚合酶的活性有明顯的抑制作用，并且隨藥物濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，藥物作用30min便可產(chǎn)生抑制。脫一氧喹賽多和脫二氧喹賽多對聚合酶活性的影響，結(jié)果顯示當(dāng)在N1位脫去氧原子時，聚合酶催化的聚合反應(yīng)初速度有明顯

11、的下降，但當(dāng)N4位脫去氧原子或N1位和N4位均脫氧時，聚合酶催化的聚合反應(yīng)初速度無明顯變化。說明N1脫一氧喹賽多也可抑制聚合酶的活性。兩種藥物直接與連接酶反應(yīng)后可對該酶催化的DNA連接反應(yīng)的初速度產(chǎn)生一定的下降作用，但當(dāng)藥物代謝后對該酶催化的連接反應(yīng)的初速度無明顯變化，說明藥物原型也可對連接酶的活性產(chǎn)生抑制。
　　由此可得出喹賽多和喹乙醇在黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶還原體系下經(jīng)還原代謝直接損傷DNA。喹賽多和喹乙醇對DNA損傷的另一途徑