女性生殖道微生物群落菌群多樣性變化與生殖道感染的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分：女性下生殖道感染相關(guān)的陰道微生物群落菌群多樣性分析
　　 背景：女性生殖道定植著數(shù)量巨大的不同種屬的細(xì)菌，其對(duì)人體健康具有重要的作用。細(xì)菌性陰道病是一種陰道微生物群落菌群紊亂性疾病，每年影響數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的育齡期女性，并與眾多的不良健康后果如早產(chǎn)及感染性傳播疾病等有關(guān)。然而，早期研究主要集中在陰道優(yōu)勢(shì)菌群在細(xì)菌性陰道病發(fā)病過程中的作用，很少了解陰道微生物群落的整體結(jié)構(gòu)和組成及其在疾病發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中的變化情況。此外，至今沒

2、有令人信服的證據(jù)證實(shí)女性生殖道中陰道微生物群落菌群多樣性變化與宮頸炎和外陰陰道假絲酵母菌病有關(guān)。
　　 方法：在本研究中，利用非培養(yǎng)的PCR-變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)和454焦磷酸測(cè)序方法，探討來自中國(guó)的細(xì)菌性陰道病患者(50例)和健康體檢女性(50例)的陰道微生物群落菌群多樣性和豐度差異，并應(yīng)用定量PCR進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。另外收集了100例受試者(包括30例細(xì)菌性陰道病患者，30例健康受試者，22例官頸炎患者，18例細(xì)菌性

3、陰道病合并宮頸炎患者)的陰道拭子和官頸外口拭子，并應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)探討女性宮頸陰道優(yōu)勢(shì)菌群多樣性，應(yīng)用針對(duì)11種細(xì)菌種屬的定量PCR探討優(yōu)勢(shì)菌群在疾病發(fā)生發(fā)展過程中的變化情況。此外，采集48例外陰陰道假絲酵母菌病患者及32例細(xì)菌性陰道病合并外陰陰道假絲酵母菌病患者的陰道拭子，應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)探討陰道微生物群落菌群的組成和多樣性。
　　 結(jié)果：本研究數(shù)據(jù)表明，在細(xì)菌性陰道病發(fā)病過程中，陰道微生物群落菌群的絕對(duì)豐度和

4、相對(duì)豐度有了一個(gè)劇烈的轉(zhuǎn)換。盡管存在顯著的個(gè)體間差異，但兩組的陰道微生物群落菌群的多樣性可被清楚地分為兩個(gè)簇。454焦磷酸測(cè)序中，共有246，359條高質(zhì)量的序列用于評(píng)估菌群多樣性，并獲得24，298獨(dú)特的可操作分類學(xué)單位(OTUs)代表了所有種系型(phylotypes)。陰道微生物群落中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌最突出的門類，屬于Firmicutes，Bacteroidetes，Actinobacteria和Fusobacteria。與以往的研究結(jié)

5、果相似，細(xì)菌性陰道病患者陰道內(nèi)存在的細(xì)菌種系型遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過健康對(duì)照組，而且發(fā)現(xiàn)大量以往研究中未曾發(fā)現(xiàn)的低豐度菌群。盡管沒有一個(gè)特異的細(xì)菌可以作為健康與細(xì)菌性陰道病發(fā)生的特異性標(biāo)志菌屬，但在患病的情況下，三個(gè)細(xì)菌門類--Bacteroidetes，Actinobacteria和Fusobacteria，及八個(gè)細(xì)菌菌屬--Gardnerella，Atopobium，Megasphaera，Eggerthella，Aerococcus，Lepto

6、trichia/Sneathia，Prevotella和Papillibacter是與細(xì)菌性陰道病密切相關(guān)的(p＜0.05)。這些菌屬是潛在的標(biāo)記物，應(yīng)用分子生物學(xué)的方法檢測(cè)這些菌屬可作為細(xì)菌性陰道病臨床診斷的靶標(biāo)應(yīng)用。不過，除產(chǎn)過氧化氫和產(chǎn)乳酸的乳桿菌外，目前沒有足夠的證據(jù)證實(shí)宮頸陰道微生物群落(包括陰道菌群和宮頸菌群)直接參與宮頸炎的發(fā)生發(fā)展。另外，本研究也沒有發(fā)現(xiàn)陰道微生物群落優(yōu)勢(shì)菌群和外陰陰道假絲酵母菌病之間的顯著相關(guān)性。

7、>　　 結(jié)論：本研究已清楚描繪出陰道微生物群落的整體結(jié)構(gòu)，并明確表明，細(xì)菌性陰道病是與陰道微生物群落菌群多樣性和生物分類學(xué)豐富性急劇增加有關(guān)。這項(xiàng)研究還提供了目前關(guān)于陰道微生物群落結(jié)構(gòu)和細(xì)菌的生態(tài)系統(tǒng)最全面的認(rèn)識(shí)，并有助于目前對(duì)細(xì)菌性陰道病病因的了解。然而，陰道微生物群落優(yōu)勢(shì)菌群和外陰陰道假絲酵母菌病之間，宮頸陰道微生物群落優(yōu)勢(shì)菌群和宮頸炎之間沒有顯著的相關(guān)性。
　　 第二部分：細(xì)菌性陰道病患者宿主陰道局部反應(yīng)性變化研究

8、>　　 背景：目前，細(xì)菌性陰道病患者宿主易感性的決定因素仍知之甚少。宿主陰道粘膜局部的感染基因組學(xué)和感染蛋白組學(xué)可能在細(xì)菌性陰道病的發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用。
　　 方法：為更深入的探索細(xì)菌性陰道病患者陰道局部對(duì)陰道菌群多樣性變化的反應(yīng)性，本研究對(duì)10例細(xì)菌性陰道病陽(yáng)性和10例細(xì)菌性陰道病陰性女性陰道上皮細(xì)胞樣本，應(yīng)用Affynetrix基因表達(dá)譜芯片研究陰道上皮細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異，并應(yīng)用Bio-PlexPro27蛋白懸液芯

9、片探討陰道灌洗液中的細(xì)胞因子表達(dá)的差異。
　　 結(jié)果：Affymetrix基因表達(dá)譜芯片分析，共有2397個(gè)基因具有2倍甚至更高的改變，其中1234個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1163個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，這些細(xì)胞因子主要參與TNF-α、NF-κB、IFN-γ、IL-5和凋亡等炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。而蛋白懸液芯片細(xì)胞因子分析后，IL-1β、IL-5、IL-12、IFN-γ、RANTES和TNF-α在細(xì)菌性陰道病的發(fā)生發(fā)展過程中具有顯著的改變(p＜0

10、.05)。
　　 結(jié)論：在細(xì)菌性陰道病發(fā)病過程，患者陰道局部宿主反應(yīng)明顯，有眾多炎癥相關(guān)的基因表達(dá)差異明顯，陰道灌洗液內(nèi)的細(xì)胞因子特別IL-1β、IL-5、IL-12、IFN-γ、RANTES和TNF-α等明顯增加，可能參與宿主抵抗細(xì)菌性陰道病相關(guān)菌群的入侵。
　　 第三部分：陰道內(nèi)應(yīng)用甲硝唑和益生乳桿菌治療細(xì)菌性陰道病的菌群重建研究
　　 背景：應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，目前已完全闡明了健康受試者和細(xì)菌性陰道病患者陰

11、道微生物群落菌群組成及其多樣性變化。然而，細(xì)菌性陰道病患者積極治療后其陰道微生物群落菌群的整體結(jié)構(gòu)及其組成，迄今為止仍然沒有深入的研究。
　　 方法和結(jié)果：應(yīng)用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)，每個(gè)樣本經(jīng)短療程治療后獲得了超過4300條的16SrRNA基因V3區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，其中30例甲硝唑治療組(7天)，25例益生乳桿菌活菌制劑(10天)及30例健康受試者和30例細(xì)菌性陰道病治療前患者分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。治療結(jié)束后，細(xì)菌性陰道病在甲

12、硝唑治療組臨床治愈率為83.3％，而乳桿菌活菌制劑治療組為88.0％。甲硝唑治療可根除細(xì)菌性陰道病相關(guān)的致病菌，明顯減少了陰道微生物群落菌群多樣性，而益生乳桿菌治療組只能通過改善陰道微生態(tài)平衡，抑制這些細(xì)菌的過度生長(zhǎng)，而不能改變陰道微生物群落菌群多樣性。盡管存在顯著的個(gè)體間差異，積極治療組或受試者的陰道菌群構(gòu)成一個(gè)獨(dú)特的簇，可與治療前組的細(xì)菌性陰道病患者明顯區(qū)分開。隨著那些細(xì)菌性陰道病的潛在致病菌，如Gardnerella，Atopob

13、ium，Prevotella，Megasphaera，Coriobacterineae，Lachnospira，Mycoplasma和Sneathia等顯著減少(p＜0.05)，一個(gè)以乳桿菌為主的陰道菌群不斷恢復(fù)，可以重建新的陰道微生態(tài)平衡。作為陰道健康狀況的哨兵細(xì)胞和生物標(biāo)志物，乳桿菌和上述細(xì)菌性陰道病相關(guān)致病細(xì)菌的相對(duì)豐度可以監(jiān)測(cè)細(xì)菌性陰道病的臨床和微生物學(xué)治愈率，及治療后復(fù)發(fā)率等。
　　 結(jié)論：本研究數(shù)據(jù)表明，陰道內(nèi)應(yīng)用甲