hsA-miR-1246在胃腺癌上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生中的作用.pdf

1、背景與目的:胃癌(Gastric cancer，GC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在腫瘤致死病因中高居第二位。其中，胃腺癌(Gastric adenocarcinoma)是胃癌的主要組織學類型，其發(fā)病率占胃惡性腫瘤發(fā)病率的95％。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是導致胃癌患者死亡的主要原因。因此，研究腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機制對降低癌癥惡性行為及提高患者生存質(zhì)量有重大意義。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，E

2、MT)是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，在腫瘤的演進過程中發(fā)揮重要作用。大量研究表明miRNA參與了多種病理生理過程，它在EMT過程中的作用不可小覷。
　　文獻表明:血清miR-1246與食管鱗狀細胞癌的TNM分期有關(guān);miR-1246等六個血清miRNAs的表達水平能夠預測早期宮頸鱗狀細胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。p53及其類似物p63和p73能靶向作用于miR-1246，后者通過抑制 DYRK1A(dual

3、-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase1 A)的表達，進而活化NFAT(nuclear factor of activated T cells)，從而引起細胞凋亡，發(fā)揮抗癌功能。本課題組在前期探討EGFL7與胃腺癌侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)系的過程中，發(fā)現(xiàn)在不同的處理組hsa-miR-1246（以下簡稱miR-1246）存在顯著的差異表達，因此我們推測miR-1246可能參與

4、了對胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)，其機制有待進一步的深入探討。本研究擬以胃腺癌細胞株BGC823和胃腺癌、胃腺癌癌旁黏膜及胃黏膜良性病變（胃炎及胃潰瘍）組織石蠟塊為研究對象，初步探討miR-1246對胃癌發(fā)生和EMT的影響。
　　方法:(1)采用探針法熒光定量PCR在組織水平檢測高、中、低分化胃腺癌組織石蠟標本miR-1246的相對表達水平。每組樣本隨機抽取相應(yīng)癌旁胃黏膜組織石蠟標本進行其miR-1246相對表達水平的檢測。選取12例胃良性

5、病變（胃炎或胃潰瘍）的胃黏膜組織石蠟標本，進行其miR-1246相對表達水平的檢測。統(tǒng)計分析miR-1246的相對表達水平與胃黏膜腺體分化水平及臨床參數(shù)之間的關(guān)系。
　　(2)采用免疫組織化學技術(shù)和免疫組化評分標準分析胃腺癌石蠟標本中E-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平，分析其與miR-1246及各項臨床數(shù)據(jù)的關(guān)系。
　　(3)采用慢病毒作為載體，對BGC823細胞分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-1246前體及陰性對照，

6、在熒光顯微鏡下確定轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)嘌呤霉素篩選得到兩個穩(wěn)定細胞株。用探針法熒光定量PCR檢測miR-1246在BGC823 miR-1246過表達組、BGC823 mimics NC組和BGC823本底組的相對表達水平，確認轉(zhuǎn)染成功，再用Western blotting檢測E-cadherin和vimentin在三組中的表達水平。拍照并觀察三組細胞的形態(tài)學變化。
　　結(jié)果:(1) miR-1246在胃腺癌、胃腺癌癌旁和胃良性病變黏膜組

7、織石蠟標本中的相對表達水平有升高的趨勢，其中胃腺癌組和胃良性病變組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，余均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。miR-1246的相對表達水平在高分化、中分化和低分化胃腺癌組織石蠟標本中有降低的趨勢，但兩兩之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。miR-1246的相對表達水平有隨TNM分期增高而降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　(2) E-cadherin在胃腺癌中的表達水平隨組織分化

8、水平增高而增高，Vimentin隨之降低，各組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。E-cadherin在胃腺癌中的表達水平有隨TNM分期增高而降低，Vimentin隨之增高的趨勢，各組間差異除在E-cadherin的T stage組間有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。miR-1246在E-cadherin陽性組的相對表達水平高于E-cadherin陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。miR-

9、1246在Vimentin陽性組的相對表達水平低于Vimentin陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(3) BGC823細胞株分別經(jīng)過慢病毒載體pre-hsa-miR-1246 mimics和慢病毒載體mimics陰性對照穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后（轉(zhuǎn)染效率在90～95％以上），建立了穩(wěn)定的BGC823 miR-1246高表達細胞株和BGC823 miR-1246陰性對照細胞株。BGC823 miR-1246高表達細胞株的miR-

10、1246的相對表達水平增高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);E-cadherin蛋白表達水平在BGC823 miR-1246高表達細胞株中相對其它兩細胞株增高，vimentin蛋白表達水平在BGC823 miR-1246高表達細胞株中相對其它兩細胞株有所降低。BGC823細胞形態(tài)在慢病毒載體mimics陰性對照組及空白對照組和慢病毒載體pre-hsa-miR-1246 mimics組之間發(fā)生改變，由前兩組的以梭形為主變?yōu)楹笠唤M的以橢圓