CtBP1介導的上皮間充質轉化促進肝細胞肝癌肉瘤樣轉化.pdf

1、肝肉瘤樣癌（sarcomatiod hepatocellular carcinoma，SHC）是指腫瘤的一部分或大部分被肉瘤樣紡錘形或梭形腫瘤細胞替代，形態(tài)學上類似肉瘤的癌，原發(fā)于肝的惡性上皮性腫瘤，惡性程度高，預后差，十分罕見。但是肝細胞肝癌在抗癌治療后發(fā)生肉瘤樣轉化率卻高達20.9％。目前肉瘤樣肝細胞肝癌缺乏有效的系統(tǒng)治療手段，故闡明肝細胞肝癌肉瘤樣轉化的發(fā)生機制，尋找高效、高選擇性的治療靶點對提高肝癌療效具有重要的意義。
　

2、　羧基末端結合蛋白1(C-terminal binding protien1，CtBP1)為轉錄輔抑制因子，能抑制上皮標記、抑癌基因和促凋亡基因的表達，從而促進上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition EMT）、細胞周期進展和抑制凋亡。
　　目的：基于以上的背景知識和我們的前期研究成果，我們的研究目的為探討CtBP1在肝細胞肝癌肉瘤樣轉化過程中的作用，并進一步的為肉瘤樣肝細胞癌的診治提供新

3、的分子靶點。
　　方法：
　　一.CtBP1在肉瘤樣肝細胞癌中的表達及臨床意義
　　1.收集肝細胞癌患者組織、癌旁組織及臨床病理參數(shù)
　　收集2008-2015年桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院手術切除的腫瘤組織病理診斷為肉瘤樣肝細胞肝癌組織標本13例和病理診斷為肝細胞肝癌的組織標本23例及其癌旁組織。相對應的癌旁組織距離腫瘤邊緣5cm。用10%福爾馬林固定所有的組織標本，石蠟包埋?；颊咴谑中g前均未進行過放化療治療。
　

4、　2.檢測組織標本中CtBP1的表達
　　用HE和免疫組化法檢測組織標本中CtBP1的表達情況。
　　二．過表達肝細胞癌細胞株的CtBP1導致的影響
　　1.細胞株的培養(yǎng)條件
　　人肝細胞癌細胞株HUH-7、7402、7404、7721及HepG2使用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、相對濕度95%的養(yǎng)箱內培養(yǎng)。
　　2.肝細胞癌細胞株中CtBP1的檢測
　　提取肝癌細胞株蛋白，通

5、過Western blot法檢測CtBP1的蛋白表達水平。
　　3.質粒提取及純化
　　從美國 abcam公司購買過表達載體，轉化、搖菌，提取質粒，NaAC-乙醇沉淀法純化質粒。
　　4.穩(wěn)定細胞株建立
　　穿梭載體PPAX2和包裝載體PMD2G與表達質粒共轉染293T細胞，生產慢病毒，采用Lipofectamine2000法感染肝癌細胞株7402和7404，建立穩(wěn)定攜帶CtBP1的肝癌細胞株。
　　5.過

6、表達CtBP1對7402、7404細胞的EMT和侵襲、遷移及增殖的影響
　　轉染CtBP1后，用Western blot法檢測7402、740細胞中CtBP1的表達，通過qRT-PCR、Western blot、Transwell、Boyden小室、CCK-8和克隆形成實驗檢測EMT相關基因的表達、遷移侵襲能力和細胞增殖能力。結果：
　　1.從免疫組化結果顯示在癌旁組織、肝細胞肝癌組織和肉瘤樣肝細胞肝癌組織中 CtBP1的表

7、達與E-cadherin的表達呈負相關、與ki67的表達呈負相關。
　　2. Western blot檢測肝癌細胞株中CtBP1的表達，結果顯示各肝癌細胞株中都有一定水平的CtBP1表達，其中HUH7、7721細胞表達較低，而7402、7404及HepG2細胞 CtBP1的蛋白水平較高。
　　3.在7402和7404細胞中外源性過表達CtBP1，用Western Blot法檢測CtBP1表達水平明顯上調。并且用Western

8、 Blot法檢測了細胞上皮性標志E-cadherin表達下降，間充質標志分子N-cadherin、Vimentin表達上調。因此，CtBP1引起了過表達CtBP1的7402和7404細胞的間充質樣表型和上皮間充質轉化樣的細胞分子標志物的改變。
　　4. Transwell、Boyden小室遷移和侵襲實驗進一步明確了過表達CtBP1后促進了7402和7404細胞的遷移和侵襲能力。
　　5. cck8和平板克隆形成實驗結果顯示過