AMPK對胃上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及胃癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、背景和目的：
　　癌癥細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤向惡性方向變化的重要標志。大部分癌癥患者死亡并非死于原發(fā)性癌而是轉(zhuǎn)移性癌。因此，本課題利用胃癌細胞模型，深入探討癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移機制，對胃癌的治療和預(yù)后具有重要的意義。
　　上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是胚胎發(fā)育過程中的基本現(xiàn)象。它不僅參與胚胎形成與發(fā)育，同時在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起著至關(guān)重要的作用，TGF-β信號是EM

2、T的主要誘導因子之一。AMPK（單磷酸腺苷活化激酶，AMP-activited Protein Kinase）是細胞內(nèi)能量感受器，調(diào)控生物體內(nèi)能量平衡。目前關(guān)于AMPK對TGF-β誘導的EMT及腫瘤侵襲遷移調(diào)節(jié)的的系統(tǒng)性研究尚未見報道。因此，本課題旨在研究AMPK對TGF-β誘導的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及細胞侵襲遷移的調(diào)節(jié)作用。
　　研究方法：
　　1.胃癌組織中AMPK活性與EMT相關(guān)指標的表達：以免疫組化技術(shù)對不同臨床

3、分期的胃癌標本中的AMPK活性與EMT指標的表達進行相關(guān)性分析。同時從醫(yī)院組織標本庫冷凍保存（-86℃）的標本中，選取16例標本，以免疫印跡技術(shù)檢測AMPK活性和EMT指標，分析兩者的相關(guān)性。
　　2.胃來源細胞株中AMPK活性與EMT相關(guān)指標的表達：以免疫印跡技術(shù)在胃來源細胞株中檢測AMPK活性和EMT指標的表達。以劃痕實驗檢測細胞的遷移能力。
　　3. TGF-β誘導EMT的發(fā)生：以免疫印跡技術(shù)檢測在TGF-β作用SGC

4、-7901和MKN-28細胞不同時間后EMT相關(guān)蛋白的表達，以劃痕實驗來觀察細胞形態(tài)變化和細胞遷移能力。
　　4. AMPK抑制TGF-β誘導的EMT：以免疫印跡技術(shù)檢測二甲雙胍在作用細胞不同時間后AMPK磷酸化蛋白表達。以免疫印跡技術(shù)檢測二甲雙胍與TGF-β聯(lián)合作用細胞后EMT相關(guān)蛋白表達，以進一步證明AMPK的激活是否能抑制EMT的發(fā)生。以劃痕實驗、Transwell實驗檢測細胞的侵襲遷移能力來觀察AMPK對細胞生物行為學的影

5、響。
　　結(jié)果：
　　1.胃癌組織中AMPK活性與EMT相關(guān)指標的表達：在不同臨床分期的胃癌標本中 p-AMPK,E-cadherin隨著分期的上升而表達下降， P-smad2,Vimentin,N-cadherind隨著分期的上升而表達增加。其中p-AMPK與P-smad2,Vimentin,N-cadherin的表達負相關(guān)，與E-cadherin的表達正相關(guān)。在16例標本中 P-smad2,Vimentin,N-cadh

6、erin的表達均高于癌旁組織，而p-AMPK,E-cadherin的表達卻在癌旁組織中高于胃癌組織。提示在胃黏膜癌變過程中p-AMPK對EMT起調(diào)節(jié)作用。
　　2.胃來源細胞株中AMPK活性與EMT相關(guān)指標的表達：胃癌細胞株（MKN28,SGC-7901,823）中Vimentin,N-cadherin表達均低，可以篩選為誘導EMT的細胞。
　　3. TGF-β誘導EMT的發(fā)生：隨著TGF-β作用時間延長，細胞逐漸形成梭形，

7、間充質(zhì)化表型逐漸顯現(xiàn)；SGC-7901和 MKN-28細胞中間充質(zhì)特性蛋白Vimentin,N-cadherin,β-catenin表達逐漸增強，上皮特性蛋白E-cadheirn表達降低。
　　4. AMPK抑制TGF-β誘導的EMT：p-AMPK,p-ACC的表達隨metformin處理時間的延長而逐漸增加；Metformin與 TGF-β聯(lián)合處理細胞后，EMT間充質(zhì)性蛋白表達較TGF-β組明顯降低；劃痕實驗中TGF-β誘導后細

8、胞遷移距離較長，而metformin+TGF-β聯(lián)合處理后，細胞遷移距離明顯減短。Transwell實驗中TGF-β誘導之后侵襲細胞數(shù)增多，而metformin+TGF-β聯(lián)合處理后，侵襲的細胞數(shù)明顯降低；
　　結(jié)論：
　　1.胃癌臨床標本中的 AMPK活性下降伴有 EMT指標的上升，并且與胃癌轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)；提示 EMT指標的上升與 AMPK活性有關(guān)；
　　2. AMPK被活化后，EMT表型將顯著下降，細胞實驗證明