谷子與銹菌互作的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜研究及相關(guān)基因表達(dá)分析.pdf

1、谷子起源于中國，在我國北方干旱地區(qū)廣泛種植。它具有抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿，營養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，在我國雜糧種植結(jié)構(gòu)中起到了重要的作用。由粟單胞銹菌引起的谷子銹病是一種危害嚴(yán)重的世界性谷子病害。在銹病流行年份，通常導(dǎo)致谷子減產(chǎn)10％～30％。本文旨在通過對接種銹菌的谷子葉片進(jìn)行Illumina高通量測序，全面、系統(tǒng)的了解谷子轉(zhuǎn)錄組特性，并探索谷子“十里香”抗銹相關(guān)基因以及抗銹相關(guān)機(jī)理，為抗銹育種提供新參考。
　　本研究采集接種銹菌0h、2

2、4 h和48 h的谷子“十里香”葉片樣本后提取RNA，利用Illumina GAⅡx進(jìn)行Solexa測序，共得到8，439，350條clean reads。將clean reads用SOAPdenovo軟件進(jìn)行從頭組裝，得到32538個(gè)Unigenes。將組裝好的32538條Unigene進(jìn)行注釋，總共有23881條Unigene獲得了注釋，其中，有23811條Unigene注釋到Nr數(shù)據(jù)庫，16350條Unigene注釋到SwissP

3、rot數(shù)據(jù)庫，12223條Unigene注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫，9250條Unigene注釋到COG數(shù)據(jù)庫，2240條Unigene注釋到GO數(shù)據(jù)庫。根據(jù)得到的注釋信息初步明確了228個(gè)與防御機(jī)制有關(guān)的基因，448個(gè)與次生代謝物的生物合成，運(yùn)輸及分解有關(guān)的基因，5個(gè)與免疫系統(tǒng)過程有關(guān)的基因，以及161個(gè)與刺激響應(yīng)有關(guān)的基因，對進(jìn)一步分析谷子與銹菌非親和互作基因表達(dá)模式，揭示谷子與銹菌相互作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上

4、，又使用Illumina HiSeqTM2000對接種銹菌0h、24h和48 h的谷子“十里香”葉片進(jìn)行了數(shù)字基因表達(dá)譜測序。構(gòu)建的3個(gè)數(shù)字化表達(dá)譜文庫分別得到3397826、3394432和3238980個(gè)clean tag。將包含32538個(gè)unigene的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫作為參考數(shù)據(jù)庫。3個(gè)數(shù)據(jù)庫的clean tag比對上了參考基因數(shù)據(jù)庫的分別有2048811、2083275和2024290個(gè)，比對上的unigene為13806、16

5、005和15426個(gè)，unambiguous tag比對上的unigene有13709、15887和15322個(gè)，占總參考基因數(shù)目的42.13％、48.83％和47.09％。將3個(gè)表達(dá)譜文庫中unambigious tag匹配上的參考基因兩兩作對比篩選差異表達(dá)基因，其中24 h與0h相比有4542個(gè)差異表達(dá)基因，48 h與0h相比有5112個(gè)差異表達(dá)基因，48 h與24 h相比有968個(gè)差異表達(dá)基因。用GO分類對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類

6、，發(fā)現(xiàn)“核糖核蛋白復(fù)合體”和“高分子配合物”是細(xì)胞組分中顯著富集最明顯的GO term;“結(jié)構(gòu)分子活性”和“有機(jī)物質(zhì)代謝過程”是分子功能中顯著富集最明顯的GO term;“細(xì)胞的氨基酸代謝過程”是生物學(xué)過程中顯著富集最明顯的GO term。對差異表達(dá)基因的KEGG pathway顯著性富集分析發(fā)現(xiàn)，在上調(diào)路徑中“核糖體”是最顯著富集的路徑，接下來依次是:“代謝途徑”、“苯丙素類生物合成”、“苯基丙氨酸，酪氨酸和色氨酸生物合成”、“精氨酸

7、和脯氨酸代謝”、“來源于莽草酸途徑的生物堿生物合成”、“類固醇生物合成”、“苯丙烷生物合成”、“類黃酮生物合成”等。通過以上分析，篩選出一些與谷子抗銹相關(guān)的蛋白激酶、轉(zhuǎn)錄因子以及病程相關(guān)蛋白等基因以及植物-病原菌相互作用路徑、苯丙烷生物合成路徑等與谷子抗銹相關(guān)的路徑，并初步推測其抗銹機(jī)制。通過轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜分析，選取了34個(gè)基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，并將定量結(jié)果與表達(dá)譜測序結(jié)果進(jìn)行對照，驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，兩種方法的

8、結(jié)果一致性達(dá)到97.06％，說明結(jié)果的可信度較高。接著，利用定量PCR比較這34個(gè)基因在抗病谷子品種“十里香”和感病品種“豫谷1號(hào)”接種銹菌后的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)這些基因在抗性材料中的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于感病材料，其中Unigene5531(GLU)、Unigene15666(CHT)、Unigene25719(PER1)、Unigene734(MKK4)、Unigene12730(WRKY7)、Unigene30025(WRKY62)、Uni

9、gene30953(WRKY70)、Unigene11273(MYB)、Unigene29832(GST24)、Unigene7613(GST29)、Unigene30834(GST)、Unigene25649(SGT)、Unigene23762(PAL)、Unigene10309(HR)、Unigene13691(XA26)、Unigene14926(NPR1)、Unigene32120(RPS1/RPM2)、Unigene16195