小麥葉銹菌與TcLr19非親和互作EST分析及TaRLP19、TaSTKC8克隆與表達.pdf

1、小麥是世界范圍內(nèi)的主要糧食作物之一。由小麥葉銹菌(Puccinia triticina)引起的小麥葉銹病是影響小麥穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的一類重要病害。該病在世界各產(chǎn)麥區(qū)均有發(fā)生,它的流行會造成嚴重的減產(chǎn)。培育抗病品種成為防治該病害最經(jīng)濟有效的方法。小麥抗葉銹病基因Lr19來源于長穗偃麥草(Agropyron elongatum),是目前國內(nèi)外具有較大應用潛力的抗葉銹病基因。本研究首先通過EST分析小麥葉銹菌與小麥TcLr19非親和互作的基因表達情況

2、;繼而以兩個TcLr19中特異表達的cDNA-AFLP片段為靶序列,通過cDNA末端快速擴增(RACE)技術獲得其cDNA序列全長,并在接菌的TcLr19、Thatcher葉片中進行實時熒光定量研究。主要研究結果如下:
　　 1.小麥TcLr19非親和cDNA文庫經(jīng)隨機測序,共獲得1512個有效ESTs,聚類拼接后得到948條非重復序列(unisequences),其中包括214個疊連群(contigs)和734個單拷貝(sin

3、glets)。Unigene基因進行同源比對及COG分析表明,651條(68.67％)非重復序列與已知功能基因同源性很高,213條(22.49%)非重復序列與未知功能基因同源,10條(1.05%)序列與小麥葉銹菌同源,74條(7.81%)非重復序列尚無同源序列。EST分析表明,該文庫包括脂類、氨基酸、核苷酸、輔酶、碳水化合物、無機離子轉運與代謝及光合作用相關基因等能量基礎代謝基因,抗病與防御類基因,信號轉導類基因,信息存儲和加工類基因、

4、轉錄翻譯相關基因及細胞骨架等。
　　 2.在功能已知的序列中,參與能量和基礎代謝類中,1,5.二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco),光系統(tǒng)Ⅱ10kd多肽蛋白,葉綠素a/b結合蛋白等參與光合作用及葉綠體結構建成的基因出現(xiàn)的頻率都較高;在抗病與防衛(wèi)相關基因中,SGT1蛋白、類RPP-8蛋白、類14-3-3蛋白、HSP70/HSP90熱休克蛋白、抗病防御基因PR10蛋白、F-box蛋白、WIR1A蛋白、過氧化氫酶等基因均存在;

5、此外,一些與(非)生物脅迫有關的基因,如過敏性反應誘導蛋白、傷誘導蛋白、脅迫反應誘導蛋白、鐵缺乏誘導蛋白、冷脅迫蛋白等均存在;在膜和轉運類基因中,ABC轉運子、H+-ATP酶類等出現(xiàn)頻率較高;信號轉導類基因包括GTP蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、類受體蛋白激酶等。推測上述高頻率基因可能參與小麥與葉銹菌的非親和互作過程。該cDNA文庫為建立研究病原菌基因及小麥抗病基因數(shù)據(jù)庫,克隆小麥抗葉銹病相關基因奠定基礎。
　　 3.以本課題組

6、前期通過cDNA-AFLP技術獲得一條在TcLr19和Tatcher與小麥葉銹菌互作時的差異表達片段19-9為靶序列,采用RACE技術在TcLr19中獲得了cDNA全長為2545bp小麥抗病相關基因,并在接菌的TcLr19中驗證得到該基因。該基因包含2136bp的開放閱讀框,編碼711個通讀的蛋白質氨基酸序列,180bp的5’非翻譯區(qū)(non translated region,UTR),243bp的3’非翻譯區(qū)和31bp的多聚腺苷酸(

7、A)尾,暫命名為TaRLP19。TaRLPl9基因編碼產(chǎn)物具有胞外結構域和單次跨膜區(qū),C末端胞內(nèi)域較短,不包括激酶域;胞外域含有6個富含亮氨酸基序(LRR),每個LRR序列大概含有23～24個氨基酸,符合典型單子葉植物所具有的LRR-TM結構模式。在GenBank獲得的登錄號為JN872563。
　　 4.以前期研究利用cDNA-AFLP技術獲得的在TcLr19和Thatcher與小麥葉銹菌互作時的差異表達片段Sr-19為靶序列

8、,采用RACE技術在TcLr19中獲得了cDNA全長為2062bp小麥抗病相關基因,該基因包含1363bp的開放閱讀框,編碼450個通讀的蛋白質氨基酸序列,275bp的5’非翻譯區(qū),434bp的3’非翻譯區(qū)和27bp的多聚腺苷酸尾,暫命名為TaSTKC8。TaSTKC8基因編碼產(chǎn)物具有STK、MSP等保守結構域。
　　 5.應用熒光定量技術對未接菌和接菌不同時間點(Oh、6h、12h、18h、24h、36h、48h、60h、72

9、h、96h、120h)的TcLr19、Thatcher進行分析,結果表明在接菌前以及接菌后120h內(nèi),TaRLP19、TaSTKC8基因在TcLr19和Thatcher中均有表達,為組成型基因。TaRLP19基因在TcLr19接菌前后出現(xiàn)表達時間提前且表達量下調的現(xiàn)象;TaSTKC8在Tclr19接菌前后呈表達高峰提前且大部分時間點的表達量增高的現(xiàn)象,由此推測該基因受葉銹菌上調表達,期間可能涉及特異基因的轉錄激活和HR及SAR反應中新蛋