TcLr19與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建及TaTCTP表達分析.pdf

1、第一部分 TcLr19與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建
　　 小麥與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建,對于研究小麥與葉銹菌互作體系中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與RNA、蛋白質(zhì)與小分子等的相互作用有著重要意義。
　　 本試驗以小麥近等基因系TcLr19和葉銹菌生理小種366為材料,二者形成不親和組合,分別在接種后4,8,12 h取材,采用SMART(Switching mechanism at5’en

2、dof RNA transcript)技術(shù),以小麥葉片mRNA為模板,分別用Oligo(dT)18 Primer和Random Primer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,通過同源重組的方法,在酵母菌株Y187中構(gòu)建了兩個小麥近等基因系TcLr19與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)過檢測,文庫的轉(zhuǎn)化率分別為1.32×106轉(zhuǎn)化子／3μg pGADT7-Rec和1.0×106轉(zhuǎn)化子／3μg pGADT7-Rec,文庫滴度分別為2.62

3、×108 pfu／mL,和3.51×108 pfu／mL,重組率分別為93％和100％。
　　 經(jīng)檢驗證實,構(gòu)建的兩個文庫具有很好的多樣性,基因長度分布比較均勻,文庫效價均≥1.0×106,完全可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的大規(guī)模篩選,該文庫的構(gòu)建為下一步篩選互作蛋白,分離和確定更多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組件,研究抗病蛋白的結(jié)構(gòu)及功能,建立更完善的小麥抗葉銹信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。這對于我們深入了解小麥抗葉銹病的分子機制,克隆小麥抗葉銹重要相關(guān)

4、基因及利用基因工程培育新的抗葉銹小麥品種具有重要意義。
　　 第二部分 TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過程中的表達分析
　　 翻譯控制腫瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP),是一種高度保守的、高表達的真核蛋白家族,廣泛存在于動物、植物及酵母中,并具有高度的同源性。大量的研究表明:TCTP是一種多功能蛋白,尤其在復(fù)雜的生命活動中具有極其重要的作用。最初認為TC

5、TP是一類生長相關(guān)蛋白,近年大量的研究結(jié)果提示TCTP可能具有非常重要的生物學(xué)功能,包括組胺釋放功能、微管結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、抗凋亡作用、調(diào)節(jié)細胞周期的進程和惡性轉(zhuǎn)移、抑制Na+、K+-ATPase活性、抗氧化、具有分子伴侶活性的熱激蛋白及抗瘧疾作用等。
　　 本實驗室長期以來從事小麥(Triticum aestivum L.)抗葉銹菌(Puccinia triticina)侵染生理機制的研究工作,已經(jīng)初步證明Ca2+、ROS

6、和細胞骨架等參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；并通過抑制性差減雜交技術(shù),構(gòu)建了TcLr19抗葉銹HR反應(yīng)早期的差異基因表達文庫,在該文庫中發(fā)現(xiàn)TCTP基因在接菌后8h和16h時大量表達。結(jié)合目前對TCTP的研究進展,初步判斷TaTCTP可能參與了小麥對葉銹菌的抗性反應(yīng)。
　　 為了進一步探討TaTCTP的功能,有必要制備TaTCTP的特異性抗體,因為它在蛋白質(zhì)的定位、定量分析及生理功能研究中是最有效、最特異的材料。本試驗首

7、先根據(jù)已知序列,以小麥近等基因泵TcLr19葉片cDNA為模板,擴增獲得了小麥翻譯控制腫瘤蛋白基因TaTCTP,構(gòu)建到表達載體pET30a(+)-GST中并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用大腸桿菌表達系統(tǒng),通過IPTG誘導(dǎo)表達TaTCTP融合蛋白。經(jīng)篩選獲得該蛋白的最佳誘導(dǎo)表達條件:LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)至菌體OD600=0.5～0.8時,加入IPTG至終濃度為0.1mmol／L,28℃誘導(dǎo)20h。進一步利用Ni-NTA純化了TaTCTP融合蛋白,

8、經(jīng)SDS-PAGE分離后由考馬斯亮藍染色證明已除去大部分雜蛋白,測定蛋白質(zhì)濃度約為1.3 mg／mL,達到了抗體制備的要求。以純化的TaTCTP融合蛋白為抗原,免疫新西蘭兔制備了抗小麥翻譯控制腫瘤蛋白的兔抗血清。TaTCTP兔抗血清的獲得為進一步探討TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過程中的時空分布特征及功能奠定了基礎(chǔ)。
　　 以小麥TcLr19接菌366后不同時間點葉片為材料,采用實時熒光定量PCR檢測TaTCTP基因在mRNA水

9、平的表達變化,Western blotting檢測TaTCTP蛋白的表達量變化。試驗結(jié)果表明,小麥近等基因系TcLr19接種葉銹菌小利P366后,TaTCTP mRNA表達量在接種后2 h時表現(xiàn)上調(diào)表達,并隨互作時間的延長,表達量逐漸上升并在24h時達到最大；而未接種對照中,TaTCTP mRNA的表達量變化不明顯。從Western blotting結(jié)果來看,所制備的抗體對小麥全蛋白質(zhì)具有很高的特異性,獲得的信號基本上呈現(xiàn)一條比較清晰的