西咪替丁對日本血吸蟲DNA疫苗免疫保護作用的影響及其機制研究.pdf

1、日本血吸蟲病是一種廣泛流行并嚴重影響人畜健康的寄生蟲病。我國目前對血吸蟲病防治的重點在于滅螺及人畜同步化療。但是由于吡喹酮僅對侵入皮膚3 h的童蟲和成蟲有效，且目前在很多國家已經(jīng)出現(xiàn)對吡喹酮敏感性降低的報道。因此，安全有效的疫苗對血吸蟲病的防治具有重要的作用。日本血吸蟲的疫苗研究經(jīng)歷了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程疫苗以及核酸疫苗等過程。其中核酸疫苗中最常用的是DNA疫苗，因其具有制備簡單、保存及運輸方便與能誘導(dǎo)廣泛和持久的體液免疫和細胞

2、免疫的優(yōu)點而備受研究者青睞。目前血吸蟲DNA疫苗在血吸蟲研究中占據(jù)著主導(dǎo)地位。但是截至目前為止，單價DNA疫苗的免疫保護效果并不令人滿意，WHO推薦的40％或以上保護力仍然沒有達到。究其原因在于，血吸蟲作為一種多細胞生物，基因組非常復(fù)雜，且在與宿主長期進化的過程中產(chǎn)生了多種免疫逃避機制。新近證實，調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）與寄生蟲逃避宿主免疫攻擊關(guān)系非常密切。在很多感染性疾病中，尤其是寄生蟲感染時Tregs的水平顯著升高，從而成為了寄生

3、蟲一個逃生的“窗口”幫助其逃避宿主的免疫攻擊。在瘧疾感染的小鼠模型中，消耗Tregs有利于機體清除病原體并降低小鼠出現(xiàn)致死性感染的可能。因此探究血吸蟲感染中Tregs的變化，并針對該變化采取相應(yīng)的治療方案必將有助于血吸蟲疫苗的研究。西咪替丁（CIM）作為H2受體阻滯劑在臨床上一直用于治療胃酸引起的胃腸功能紊亂并有確定的療效。除此之外，CIM在臨床上還廣泛的用于治療皰疹病毒，HIV病毒等感染性疾病引起的免疫功能下降，以及阻抑腫瘤的發(fā)生及生

4、長。研究表明，其作用機制主要在于抑制抑制性T細胞的功能從而發(fā)揮免疫增強作用。有報道稱，直接將CIM和吡喹酮合用可顯著提高吡喹酮的殺蟲效果。同時也有很多將CIM作為一種免疫調(diào)節(jié)劑來增強疫苗的免疫原性的報道。本研究選用CIM和日本血吸蟲26KD谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Sj26）DNA疫苗合用，一方面觀察CIM和日本血吸蟲pEGFP-Sj26GST DNA疫苗聯(lián)合使用的免疫保護作用；另一方面觀察CIM和日本血吸蟲pEGFP-Sj26GST DNA

5、疫苗聯(lián)合使用后宿主體內(nèi)Tregs的變化，并探討其免疫機制。本研究分為以下三個部分：
　　 第一部分：西咪替丁對日本血吸蟲感染小鼠免疫應(yīng)答的影響研究。
　　 目的：探討不同劑量的CIM對血吸蟲感染小鼠免疫應(yīng)答的影響。
　　 方法：32只6-8周齡的BALB/c雌性小鼠隨機分成3組，即50 mg/kg CIM組（CIM50）、25mg/kg CIM組（CIM25）及感染對照組（Control）。CIM50組采用50

6、mg/kg的CIM皮下注射三次，每次間隔兩周；CIM25組采用25mg/kg的CIM皮下注射三次，每次間隔兩周，即第1、14、28天分別用藥一次；Control為單純感染組。第42天時各組小鼠攻擊感染日本血吸蟲尾蚴40條/鼠。感染后第6周殺鼠取脾淋巴細胞計數(shù)，檢測脾淋巴細胞中CD4+CD25+FoxP3+Tregs百分比及IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-5水平。
　　 結(jié)果：和感染對照組相比，使用25mg/kg CIM組調(diào)

7、節(jié)性T細胞的比例顯著降低（P＜0.01）且小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IFN-γ的水平均較對照組升高（P＜0.05），而IL-4、IL-5的水平較對照組則無顯著性差異（P> 0.05）。而和感染對照組相比，使用50mg/kg CIM組在調(diào)節(jié)性T細胞的比例及小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中細胞因子的水平上均與對照組無顯著性差異（P> 0.05）。
　　 結(jié)論：CIM可作為免疫調(diào)節(jié)劑，增強小鼠的免疫功能，從而提高小鼠對血吸蟲感染的免疫保護作用

8、，但是該作用與劑量有關(guān)。
　　 第二部分：西咪替丁和日本血吸蟲pEGFP-Sj26GST DNA疫苗聯(lián)合使用的免疫保護作用研究。
　　 目的：觀察CIM對pEGFP-Sj26GST DNA疫苗免疫保護作用的影響。
　　 方法：從本室保存的DH5α大腸桿菌體內(nèi)提取已構(gòu)建好的pEGFP-Sj26GST重組質(zhì)粒，進行鑒定。50只BALB/c小鼠隨機分為5組，即感染對照組、CIM單用組、pEGFP-N3空載體對照組、pE

9、GFP-Sj26GST DNA疫苗組及CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組。其中疫苗組每只小鼠在第1、14及28天時分別經(jīng)股四頭肌注射100 μg pEGFP-Sj26GST DNA疫苗或pEGFP-N3空載體，CIM組每只小鼠從首次免疫前兩天開始每天皮下注射25mg/kg的CIM直至感染前。末次免疫后2周，各組小鼠均經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴40條/鼠。感染后第6周殺鼠沖蟲，計數(shù)每只小鼠的蟲荷及肝內(nèi)蟲卵數(shù)。計算減蟲率

10、和肝組織中每條雌蟲的減卵率。取出小鼠肝組織用福爾馬林固定，脫水、石蠟切片、HE染色，檢測各組小鼠肝組織內(nèi)蟲卵肉芽腫的變化。
　　 結(jié)果：將大量提取出的pEGFP-Sj26GST重組質(zhì)粒及pEGFP-N3空載體質(zhì)粒在核酸分析儀上檢測發(fā)現(xiàn)濃度達到3mg/ml且純度較高。動物保護性試驗結(jié)果顯示，CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗聯(lián)合使用后減蟲率高達79％，顯著高于pEGFP-Sj26GST疫苗單獨使用組（27％）及其他各組

11、。肝臟內(nèi)蟲卵計數(shù)發(fā)現(xiàn)其肝減卵率與pEGFP-Sj26GST DNA疫苗單用組相比，聯(lián)合使用CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗也有顯著的降低（22.48％vs68.35％）。小鼠肝組織HE染色顯示，和感染對照組相比，CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組的蟲卵肉芽腫數(shù)目(16.25±2.87vs4.5±1.76)顯著減少。顯微鏡下可見，感染對照組的肝肉芽腫體積較大，而pEGFP-Sj26GST疫苗組及與CIM合用

12、組的肝肉芽腫體積則明顯縮小。
　　 結(jié)論：CIM可作為佐劑增強血吸蟲pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保護效果。且CIM和疫苗合用可以顯著減少血吸蟲感染宿主肝內(nèi)蟲卵肉芽腫的數(shù)目。
　　 第三部分：西咪替丁增強日本血吸蟲pEGFP-Sj26GST DNA疫苗的免疫保護作用的機制研究。
　　 目的：觀察CIM對宿主體內(nèi)CD4+CD25+Tregs及相關(guān)細胞因子的影響，探討CIM增強pEGFP-Sj26GST

13、 DNA疫苗免疫保護作用的機制。
　　 方法：80只雌性BALB/c小鼠隨機分成五組，即感染對照組、CIM組、pEGFP-N3空載體對照組、pEGFP-Sj26GST DNA疫苗組及CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組。其中疫苗組每只小鼠在第1、14及28天時分別經(jīng)股四頭肌注射100 μg pEGFP-Sj26GST DNA疫苗或pEGFP-N3空載體，即每只小鼠免疫三次，每次間隔2周。CIM組每只小鼠從首次免疫

14、前兩天開始每天皮下注射25mg/kg的CIM直至感染前。各組取6只小鼠在末次免疫后一周剖殺，取眼眶血，靜置后離心取上清，檢測其血清中特異性GST抗體的含量。將剩余的50只小鼠在末次免疫后2周均經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴40條/鼠。感染后第6周，剖殺小鼠，無菌取脾，制備單個脾細胞懸液，流式細胞儀檢測脾淋巴細胞中CD4+CD25+Tregs百分比。將無菌取出的脾細胞懸液在體外用絲裂原ConA刺激后培養(yǎng)48小時，MTT法檢測在體外各組脾細胞

15、對絲裂原的增值比率。體外培養(yǎng)72小時離心收集各組脾細胞上清，夾心ELISA法分別檢測脾細胞上清中Th1細胞因子γ-干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）和Th2細胞因子白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）和白細胞介素-10（IL-10）等細胞因子含量。
　　 結(jié)果：⑴使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗后小鼠血清中特異性的抗Sj26GST抗體的水平明顯高于空載體組及單用CIM組（p＜0.05），

16、且將pEGFP-Sj26GST DNA疫苗和CIM合用后小鼠血清中特異性的抗Sj26GST抗體的水平亦顯著高于單獨使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗組。⑵和感染對照組相比，單用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗可以降低其脾淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例（p＜0.05），而將CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用則可以顯著降低其脾淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例。⑶和感染對

17、照組相比，單用CIM后脾淋巴細胞對ConA的增殖反應(yīng)明顯提高，而合用CIM及pEGFP-Sj26GST DNA疫苗后，脾淋巴細胞對ConA的增殖反應(yīng)則較單獨使用pEGFP-Sj26GST DNA疫苗組亦有顯著提高。⑷CIM和pEGFP-Sj26GST DNA疫苗合用組小鼠脾細胞培養(yǎng)上清中IL-12、IFN-γ的水平均較感染對照組高（P＜0.05），IL-10的含量較對照組降低（P＜0.05），而IL-4、IL-5的水平雖較對照組升高，但