日本血吸蟲雌雄合抱相關蛋白的分離、鑒定及其DNA疫苗的研究.pdf

1、血吸蟲病是一個嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題，全球每年超過6億人口受到血吸蟲感染的威脅，約2億人口被感染。目前，控制血吸蟲病的主要策略是用安全有效的藥物對感染人群進行化療，但化療并不能預防人群的反復再感染，致使疫情易于反彈。當前，國家提出現(xiàn)階段以控制傳染源為主的綜合防治新策略，對于湖區(qū)血吸蟲病疫情的控制將起到重要的作用。日本血吸蟲(Sj)的一個顯著特點是雌雄異體但又終生合抱。雌雄合抱是血吸蟲生長發(fā)育、成熟、產卵的前提，而蟲卵是造成病理損害和病

2、原體傳播的關鍵因素。阻斷傳播型抗血吸蟲卵胚發(fā)育和抗雌蟲生殖產卵的研究，一直是本課題組的重要攻關內容。在1999年-2000年我國總理基金血防重點項目結題后進行的全國血吸蟲疫苗免疫保護統(tǒng)一檢測實驗中，由本室構建的天然分子疫苗(1號疫苗)在全國16種候選疫苗中獲得了最佳的動物保護效果。本文在此研究基礎上，利用雙向電泳和質譜技術，鑒定了9個日本血吸蟲雌雄合抱相關蛋白，從中選用編碼血吸蟲雌雄合抱相關蛋白SJCHGC基因為疫苗候選分子，進行克隆、

3、表達及DNA疫苗構建，以考核其作為抗日本血吸蟲病疫苗候選分子的潛在價值，為抗日本血吸蟲雌雄合抱和抗生殖疫苗的制備及應用提供實驗依據。 研究方法: 1)利用雙向凝膠電泳和MALDI—TOF質譜分析等蛋白質組學方法，對比研究了日本血吸蟲雄蟲在合抱與未合抱狀態(tài)下蛋白質表達上的差異，并在mRNA水平進行進一步驗證。 2)采用生物信息學等技術對獲得的日本血吸蟲雌雄合抱相關蛋白SJCHGC(Sj22.7)編碼基因序列進行開放

4、閱讀框(ORF)的尋找，編碼氨基酸的推導，蛋白質同源性比較以及二、三級結構的預測。 3)通過用陽離子脂質體Lipofectamine2000將重組質粒DEGFP-Cl/SJCHGC轉染COS-7細胞，用熒光顯微鏡直接觀察pEGFP-Cl/SJCHGC融合蛋白在細胞中的分布和定位，用RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot方法驗證其mRNA和蛋白的表達。 4)用PCR特異性擴增SJCHGC基因，將其克隆入真

5、核表達載體DcDNA3，構建DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC，并通過PCR、雙酶切及測序鑒定。將pcDNA3/SJCHGC經脂質體轉染Hela細胞，檢測SJCHGC蛋白的體外瞬時表達。免疫接種并攻擊感染小鼠，檢測重組質粒在小鼠肌肉組織中的表達情況，以減蟲率、減卵率和每雌肝卵數(shù)評價其免疫保護性。 5)用DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC免疫接種并攻擊感染小鼠，通過ELISA法測定血清中總IgG抗體水平，并以Western b

6、lot分析抗SJCHGC特異性抗體。四甲基偶氮唑鹽試驗(MTT法)檢測免疫小鼠T淋巴細胞增殖反應。攻擊感染后以脾細胞培養(yǎng)法檢測經血吸蟲雄蟲可溶性抗原(AWAm)刺激后，小鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-4的水平。 結論: 1)建立了日本血吸蟲合抱前后雄蟲雙向凝膠電泳圖譜，并應用質譜技術成功鑒定了9個血吸蟲雄蟲合抱相關的差異表達蛋白質，其功能涉及血吸蟲的生長發(fā)育、生殖、營養(yǎng)、運動、信號傳遞等過程。為血吸蟲蛋白質組數(shù)據庫的建立

7、提供了有意義的數(shù)據，為揭示日本血吸蟲雌雄合抱的機制提供新的線索和思路。 2)生物信息學分析示：SJCHGC的編碼蛋白含有2個Efh(EF-hand)保守結構功能域，即鈣結合基序，屬于鈣傳感器和鈣調節(jié)基因的超家族成員，存在多個潛在抗原表位與特定功能位點，可能為一重要的胞漿內信號轉導分子。屬首次發(fā)現(xiàn)并報導的與日本血吸蟲雌雄合抱相關的蛋白質，進一步研究其功能具有重要的生物學意義。 3)重組質粒pEGFP-C1/SJCHGC轉染

8、COS-7細胞，可用熒光顯微鏡直接觀察pEGFP-C1/SJCHGC融合蛋白在COS-7細胞中的表達和胞漿中亞細胞定位，細胞所表達的融合蛋白具有血吸蟲抗原性，為該基因功能研究提供了線索。 4)DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC可誘導小鼠產生較顯著的抗血吸蟲攻擊感染的免疫保護力，減蟲率為29.70％，肝減卵率為47.25％，腸減卵率為51.77％，每雌肝減卵率為25.90％，具有明顯的抗雌蟲生殖能力。提示，該核酸疫苗可作為新的有