FoxO1介導(dǎo)的脂聯(lián)素信號受損在糖尿病心肌缺血-再灌注損傷中的作用.pdf

1、研究背景：
　　高血糖或高血脂是糖尿病的標(biāo)志，會導(dǎo)致心肌缺血/再灌注（MI/R）后心肌易損性的增加。糖尿病患者發(fā)生心肌缺血時，心肌細(xì)胞死亡數(shù)量、心功能損傷程度及再灌注后無復(fù)流現(xiàn)象較非糖尿病患者顯著增加。但是，糖尿病心肌缺血損傷加重，進(jìn)而導(dǎo)致死亡率增高的機制尚未完全闡明。所以，闡明糖尿病MI/R損傷的分子機制至關(guān)重要，有望為防治糖尿病MI/R損傷提供新思路和新靶點。
　　脂聯(lián)素是主要由脂肪細(xì)胞分泌的一個細(xì)胞因子，主要發(fā)揮增強胰

2、島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化及心臟保護(hù)作用。脂聯(lián)素水平在肥胖相關(guān)疾病如冠狀動脈疾病和2型糖尿病時均顯著下降。而給予外源脂聯(lián)素或增加脂聯(lián)素的分泌均可通過增強胰島素敏感性降低血糖。近年來發(fā)表的一些文獻(xiàn)表明心肌細(xì)胞同樣可以合成和分泌脂聯(lián)素，認(rèn)為心肌細(xì)胞分泌的脂聯(lián)素在保護(hù)缺血/再灌注(I/R)后心肌損傷方面發(fā)揮重要作用。
　　FoxO家族是近年來的一個研究熱點，參與多種生物反應(yīng)過程，包括細(xì)胞周期，細(xì)胞死亡，分化，代謝，并且在胰島素信號

3、通路中發(fā)揮重要作用。FoxO1是FoxO家族中研究最多、作用最強的一種亞型。很多研究均表明糖尿病高甘油三脂血癥與FoxO1引起的葡萄糖和脂肪代謝失調(diào)密切相關(guān)。盡管有研究表明FoxO1可以促進(jìn)脂肪組織脂聯(lián)素表達(dá)的增加，但其它研究結(jié)果證實在糖尿病時FoxO1會抑制促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)的PPARγ基因的表達(dá)，所以FoxO1對脂聯(lián)素表達(dá)的調(diào)節(jié)可能與病生理狀態(tài)、細(xì)胞類型和上游信號有關(guān)。因此我們設(shè)想：糖尿病時FoxO1的過度生成引起的脂聯(lián)素水平下降可能是

4、I/R后心肌損傷加重的重要原因。本研究擬對該假設(shè)進(jìn)行驗證，進(jìn)而闡明分子機制，為進(jìn)一步闡明糖尿病I/R后心肌損傷加重的機制提供新的實驗依據(jù)。
　　研究目的：
　　1．建立糖尿病小鼠心臟 I/R模型，觀察糖尿病小鼠心臟組織是否存在FoxO1激活，F(xiàn)oxO1激活與糖尿病小鼠MI/R損傷加重是否有關(guān)；
　　2．在體心肌點注射FoxO1 siRNA抑制其表達(dá)，觀察脂聯(lián)素及其受體的變化以及MI/R損傷的變化，明確 FoxO1過度生

5、成在2型糖尿病MI/R后心肌易損性增強中的作用以及；
　　3．在高糖培養(yǎng)心肌細(xì)胞實驗中，觀察高糖作用下 FoxO1是否被激活；轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA后觀察脂聯(lián)素表達(dá)變化，以及SI/R后AdipoR1表達(dá)和細(xì)胞凋亡的變化。在細(xì)胞水平驗證MI/R時FoxO1對脂聯(lián)素及AdipoR1信號的調(diào)節(jié)作用及具體分子機制；
　　4．APN-/-小鼠心肌點注射FoxO1 siRNA，觀察MI/R損傷的變化，進(jìn)一步驗證在糖尿病動物MI/R損

6、傷時，下調(diào) FoxO1是否會通過逆轉(zhuǎn)脂聯(lián)素及其受體的下調(diào)，進(jìn)而起到心臟保護(hù)的作用。
　　研究方法：
　　1．選取體重20-25g雄性C57B16/J小鼠，高脂飼料喂2 w，腹腔注射50mg/kg STZ，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)6 w，血糖≥10mmol/L認(rèn)為糖尿病模型成功。
　　2.體內(nèi)導(dǎo)入siRNA：2％異氟烷麻醉小鼠，消毒皮膚，擠出心臟，在預(yù)計動脈結(jié)扎部位下方用30G針頭心肌點注射 FoxO1 siRNA/RNAi-Mat

7、e復(fù)合物20μg/20μL，大約注射2-3個點。48小時后行MI/R。
　　3.小鼠 MI/R模型：用6-0絲線在小鼠冠脈左前降支中點處結(jié)扎，30 min后再灌注。再灌注3 h后檢測心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)，再灌注24 h后檢測心功能及心梗面積。假手術(shù)組采用同樣的方法處理，區(qū)別在于不結(jié)扎LAD。
　　4.乳鼠心肌細(xì)胞高糖培養(yǎng)（25mmol/L）24h后轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA/RNAi-Mate復(fù)合物，24h后行SI/R

8、。
　　5.心肌梗死面積測定：伊文氏藍(lán)/三苯四唑氯鹽（TTC）雙染色法。
　　6.心肌細(xì)胞凋亡檢測：①末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法；②Caspase-3活性測定（ELISA）。
　　7. Western-blot檢測FoxO1、脂聯(lián)素及AdipoR1蛋白水平。
　　8.實時定量PCR檢測FoxO1 mRNA水平。
　　實驗結(jié)果：
　　1.相較于正常小鼠，2型糖尿病小鼠

9、心肌FoxO1蛋白表達(dá)增加（P<0.05），而心肌來源的脂聯(lián)素（P<0.05）與AdipoR1表達(dá)減少（P<0.05）。同時，I/R后2型糖尿病小鼠心肌梗死面積增加（P<0.05）、心肌細(xì)胞凋亡增多及caspase-3活性進(jìn)一步增加（P<0.05）。
　　2.給予心肌點注射 FoxO1 siRNA可以有效減少糖尿病小鼠過度生成的FoxO1 mRNA及蛋白（P<0.05）。而心肌FoxO1表達(dá)的下降促進(jìn)心肌來源的脂聯(lián)素與AdipoR

10、1表達(dá)的恢復(fù)（P<0.05）。
　　3.抑制糖尿病小鼠心肌 FoxO1表達(dá)可明顯減少 MI/R后的心梗面積（P<0.05）、改善心功能（P<0.05），同時抑制心肌細(xì)胞凋亡（P<0.05）及caspase-3活性（P<0.05）。另外，與脂聯(lián)素變化一致，其下游 AMPK活性恢復(fù)。
　　4.相較于正常條件培養(yǎng)，高糖培養(yǎng)的小鼠心肌細(xì)胞FoxO1 mRNA及蛋白表達(dá)增加（P<0.05），轉(zhuǎn)染FoxO1 siRNA可有效抑制FoxO

11、1 mRNA及其蛋白表達(dá)（P<0.05）。抑制 FoxO1表達(dá)可促進(jìn)高糖條件下脂聯(lián)素水平的恢復(fù)（P<0.05），可促進(jìn)高糖培養(yǎng)條件下SI/R后AdipoR1表達(dá)的恢復(fù)（P<0.05）以及心肌細(xì)胞凋亡的減輕（P<0.05）。
　　5. APN-/-小鼠心肌點注射 FoxO1 siRNA后可減少 FoxO1 mRNA表達(dá)（P<0.05），但抑制FoxO1表達(dá)對APN-/-小鼠MI/R損傷沒有顯著的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：
　

12、　1.糖尿病小鼠較正常小鼠心肌FoxO1表達(dá)增高，而對MI/R損傷有保護(hù)作用的脂聯(lián)素與AdipoR1表達(dá)減少，提示FoxO1可能通過下調(diào)糖尿病心肌脂聯(lián)素信號加重MI/R損傷。
　　2.給予心肌點注射FoxO1 siRNA抑制FoxO1表達(dá)可減輕糖尿病MI/R損傷，同時心肌來源的脂聯(lián)素和AdipoR1表達(dá)恢復(fù)。進(jìn)一步提示糖尿病狀態(tài)下FoxO1過度生成引起的脂聯(lián)素減少是引起糖尿病小鼠MI/R損傷加重的原因。
　　3.高糖培養(yǎng)的心