Epac-Rap1信號通路介導(dǎo)牡荊素抗大鼠心肌缺血-再灌注損傷中的保護(hù)作用機(jī)制.pdf

1、目的：
　　研究Epac-Rap1（exchange proteins directly activated by cAMP-Ras-related protein1）信號通路在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用，探討藥理學(xué)調(diào)控此信號途徑是否為心肌缺血再灌注損傷的重要治療分子靶點，并探明Epac-Rap1信號通路介導(dǎo)牡荊素抗大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用機(jī)制，為牡荊素應(yīng)用于臨床提供理論實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.取S

2、D（Sprague Dawley）雄性大鼠隨機(jī)分為7組，分別為假手術(shù)組、缺血再灌注1h組、缺血再灌注2h組、缺血再灌注4h組、缺血再灌注8h組、缺血再灌注16 h組、缺血再灌注24 h組。采用6-0線結(jié)扎法，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支建立心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型。缺血1 h，再灌注1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h，并記錄大鼠心肌缺血前、缺血1 h、再灌注結(jié)束時的心電圖。HE染色觀察大鼠左心室心肌組織的病理學(xué)變化

3、；ELISA檢測再灌注不同時間大鼠血清中cAMP的含量變化。Western Blot檢測大鼠心肌組織中Epac1、Rap1、CaMKⅡ和p-ERK的蛋白表達(dá)變化；免疫熒光檢測大鼠心肌組織中Epac1、Rap1的表達(dá)；實時熒光定量PCR檢測Epac1、Rap1的mRNA的表達(dá)變化。
　　2.取SD雄性大鼠隨機(jī)分為11組，分別為假手術(shù)組、MIRI模型組、8-CPT組、ESI-09組、6-BNZ組、H-89組、牡荊素+8-CPT組、牡荊

4、素+ESI-09組、牡荊素組、牡荊素+6-BNZ組、牡荊素+H-89組。采用6-0線結(jié)扎法，結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支，缺血1h，再灌注4h，建立大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）模型。并記錄實驗過程中大鼠的心電圖。HE染色觀察大鼠左心室心肌組織的病理學(xué)變化；ELISA檢測再灌注不同時間大鼠血清中cAMP的含量變化。Western Blot檢測Epac1、Rap1、CaMKⅡ和p-ERK的蛋白表達(dá)變化；免疫熒光檢測心肌組織中Epac1、R

5、ap1的表達(dá)；實時熒光定量PCR（Q-PCR）檢測Epac1、Rap1的mRNA的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.與假手術(shù)組相比，模型組（再灌1h、2h、4h、8h、16h、24h組）大鼠心肌缺血時ST段明顯抬高，再灌注結(jié)束時ST段下降，但仍高于假手術(shù)組，并且隨著再灌注時間延長，ST段降低的幅度越大。HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組大鼠心肌組織染色均勻，排列整齊，顯示正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)架和心肌纖維。而模型組大鼠正常心肌結(jié)構(gòu)不完整，排列紊

6、亂，并有大量炎細(xì)胞浸潤。再灌注4h后，大鼠心肌可見有瘢痕組織，膠原纖維逐漸增多。ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)對照組比較，模型組大鼠血清中cAMP含量明顯增加，隨著大鼠心肌再灌注時間延長（1 h至24 h），血清中cAMP的含量逐漸增高，呈時間依賴性。Western Blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Epac1、Rap1和CaMKⅡ蛋白表達(dá)增加，同時ERK磷酸化增加，并且隨著再灌注時間的延長（1h至24h），大鼠心肌組

7、織中Epac1、Rap1和CaMKⅡ蛋白表達(dá)逐漸增加，同時ERK磷酸化逐漸增多。免疫熒光結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Epac1和Rap1蛋白表達(dá)明顯升高，從再灌1 h到24 h，Epac1和Rap1的表達(dá)量逐漸增加。Q-PCR結(jié)果顯示，大鼠心肌組織中Epac1和Rap1的mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，隨著再灌注時間的延長，其表達(dá)量逐漸增加，與心肌缺血再灌注時間呈正相關(guān)。
　　2.與假手術(shù)組比較，在缺血1 h、再灌

8、4 h時模型組的ST段都明顯明顯抬高，與模型組相比較，Epac激動劑（8-CPT）組可顯著抬高ST段，Epac抑制劑（ESI-09）組、牡荊素（VT）組、ESI-09+牡荊素與H-89+牡荊素聯(lián)合組可明顯抑制大鼠ST段的抬高。HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠心肌組織染色均勻，排列整齊，未見明顯異常改變，而MIRI模型組的大鼠正常心肌結(jié)構(gòu)不完整，排列紊亂，并有大量炎細(xì)胞浸潤，可見膠原纖維和瘢痕組織出現(xiàn)。與模型組比較，Epac激動劑可加重缺血

9、心肌組織的損傷，Epac抑制劑、牡荊素（VT）組、ESI-09+牡荊素與H-89+
　　牡荊素聯(lián)合組均可顯著減輕缺血心肌的損傷。ELISA結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中cAMP的含量顯著增加，Epac激動劑和PKA激動劑組大鼠血清中cAMP的含量較單純模型組進(jìn)一步增加，Epac抑制劑、PKA抑制劑和牡荊素均可降低大鼠血清中cAMP的水平。Western Blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中Epac1、

10、Rap1、CaMKⅡ蛋白表達(dá)明顯增加，同時其ERK磷酸化水平明顯增加，Epac激動劑可上調(diào)大鼠心肌組織Epac1、Rap1、CaMKⅡ蛋白表達(dá)和ERK磷酸化水平，Epac抑制劑與牡荊素及其聯(lián)合用藥組均可下調(diào)大鼠心肌組織中Epac1、Rap1、CaMKⅡ蛋白表達(dá)以及增加ERK磷酸化水平，PKA激動劑可上調(diào)CaMKⅡ蛋白表達(dá)，增加ERK磷酸化水平，PKA抑制劑可下調(diào)CaMKⅡ蛋白表達(dá)并增加ERK磷酸化，對Epac1和Rap1蛋白表達(dá)無明顯影

11、響。免疫熒光結(jié)果顯示，模型組大鼠Epac1、Rap1蛋白在心肌組織中的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，Epac激動劑可增加Epac1、Rap1蛋白在心肌組織表達(dá)，Epac抑制劑和牡荊素均可抑制Epac1、Rap1蛋白在心肌組織表達(dá)，PKA激動劑和抑制劑對Epac1和Rap1蛋白在心肌組織表達(dá)無明顯影響。PCR結(jié)果顯示，模型組的Epac1、Rap1的mRNA表達(dá)明顯高于假手術(shù)組，Epac激動劑可上調(diào)Epac1、Rap1的mRNA表達(dá)，Epac抑

12、制劑和牡荊素下調(diào)Epac1、Rap1的mRNA表達(dá)，PKA激動劑和抑制劑對Epac1和Rap1的mRNA含量表達(dá)無明顯影響。
　　結(jié)論：
　　研究結(jié)果顯示，大鼠MIRI后，心肌組織中cAMP水平升高，心肌細(xì)胞內(nèi)信號分子Epac1激活，表達(dá)上調(diào)，并導(dǎo)致其下游的Rap1激活，促進(jìn)心肌損傷；Epac1激動劑（8-CPT）可進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞Epac1過表達(dá)和下游Rap1激活，加重心肌損傷；Epac1抑制劑（ESI-09）可抑制MI

13、RI心肌細(xì)胞Epac1的激活，抑制其過表達(dá)和下游Rap1激活，并抑制Epac1mRNA及Rap1mRNA基因表達(dá)，同時抑制其下游CaMKⅡ蛋白的表達(dá)和ERK的磷酸化，減輕心肌病理性損傷；牡荊素(3mg/kg)可顯著抑制MIRI大鼠心肌組織損傷，抑制MIRI大鼠心肌細(xì)胞Epac1的激活，并抑制其過表達(dá)和下游Rap1活化，同時抑制其下游CaMKⅡ蛋白的表達(dá)和ERK的磷酸化，以及抑制Epac1mRNA及Rap1mRNA基因表達(dá)，Epac1抑制