內(nèi)皮素-1在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究.pdf

1、本研究分為以下兩個(gè)章節(jié):
　　第一章 ET-1對(duì)離體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的:
　　本研究將通過(guò)建立Langendorf離體心臟灌注模型，并在此模型的基礎(chǔ)上研究不同濃度的ET-1對(duì)于心臟的不同作用及其可能的相關(guān)機(jī)制，再進(jìn)一步探討SK&F96365和LOE908對(duì)于ET-1的影響以及對(duì)心臟的保護(hù)作用。
　　材料與方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　本研究選用體重180-220g的雄性SD大鼠，購(gòu)

2、于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及處理方法，嚴(yán)格按照廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行，并盡可能減少動(dòng)物的使用數(shù)量。
　　2.動(dòng)物L(fēng)angendorff模型的制備及分組
　　將離體大鼠心臟懸于Langendorff灌注裝置，以恒壓恒溫的方式進(jìn)行逆灌。停止K-H灌注液的灌注即為全心缺血，然后再恢復(fù)灌注。大鼠隨機(jī)分為五組:1）缺血再灌注（I/R）組:用K-H液心臟灌注30min，然后停止灌注液造成全心缺血30mi

3、n，再恢復(fù)灌注60min。2）ET-1預(yù)處理組:在I/R組的基礎(chǔ)上，在缺血一開(kāi)始，分別單次注射ET-10.1 nM，1nM，10nM。3）BQ123處理組(BQ123組):在ET-11nM組的基礎(chǔ)上，在注射ET-1的前5 min開(kāi)始持續(xù)灌注2心MBQ-123。4) SK&F96365處理組:在ET-110 nM組的基礎(chǔ)上，在注射ET-1的前5 min開(kāi)始持續(xù)灌注30μM SK&F96365。5）LOE908處理組（LOE908組）:在E

4、T-110 nM組的基礎(chǔ)上，在注射ET-1的前5 min開(kāi)始持續(xù)灌注30μM LOE908。
　　3.各項(xiàng)指標(biāo)的觀察
　　應(yīng)用PcLab-UE生物醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)實(shí)時(shí)觀察分析并且記錄灌注10min、30min以及再灌注后5 min，10 min，30 min和60 min各個(gè)時(shí)刻的左室最大心室壓、左室最小心室壓、左室舒張末壓(LVEDP)以及心率。測(cè)定各個(gè)時(shí)點(diǎn)一分鐘內(nèi)的冠脈流量(CF)。收集恢復(fù)灌注后5min的冠脈流出液

5、，檢測(cè)其中的乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的含量。對(duì)再灌注結(jié)束的大鼠心臟，留取左心室進(jìn)行HE染色并進(jìn)行觀察。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間均數(shù)多重比較應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊則采用LSD方法，不齊則采用Dunntt-T3方法。兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜

6、0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.不同濃度ET-1對(duì)于離體心臟功能的不同影響
　　0.1nM和1 nM ET-1明顯改善了心功能，表現(xiàn)為L(zhǎng)VDP明顯升高(93.89±21.84，80.35±8.62mmHg)，LVEDP顯著下降(8.05±2.64，16.17±7.09mmHg)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。心肌酶LDH和CK的含量顯著降低(P=0.000和0.004，P=0.000和0.007)，

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組織病理學(xué)檢查顯示損傷減輕。然而10nM ET-1在CF方面(4.33±1.03 ml/min)有著顯著下降(P＜0.05)，顯示其強(qiáng)有力的收縮作用，不利于心肌的保護(hù)。
　　2.ETA受體在ET-1心肌保護(hù)中的作用
　　BQ-123抑制了ET-1的保護(hù)作用，使得LVDP明顯降低(26.22±6.78 mmHg)，而LVEDP顯著升高(14.80±3.87 mmHg)，心功能減弱，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

8、＜0.05)。LDH和CK的含量顯著增加(P=0.032和0.023)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。組織病理學(xué)檢查顯示損傷加重。可見(jiàn)ETA受體可能參與其中。
　　3.SK&F96365和LOE908對(duì)于ET-1在心肌的影響
　　SK&F96365和LOE908明顯改善了心功能，LVDP明顯升高(82.08±17.28，70.58±7.45 mmHg)，LVEDP顯著下降(9.50±3.43，和11.34±3.69 mmHg

9、)，CF明顯增加(8.17±0.75、7.50±1.38 ml/min)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。心肌酶LDH和CK的含量顯著降低（P=0.000和0.012，P=0.000和0.021）。組織病理學(xué)檢查顯示損傷減輕。SK&F96365和LOE908對(duì)于10 nM ET-1的血管收縮作用有一定的抑制作用，起到增強(qiáng)其心肌的保護(hù)作用。
　　第二章 SK&F96365和LOE908對(duì)在體心臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用
　　目的

10、：本研究將通過(guò)建立在體心臟缺血再灌注模型，并在此模型的基礎(chǔ)上研究SK&F96365和LOE908對(duì)于ET-1的影響以及對(duì)心臟的保護(hù)作用。
　　材料與方法：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　本研究選用體重180-220g的雄性SD大鼠，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及處理方法，嚴(yán)格按照廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求進(jìn)行，并盡可能減少動(dòng)物的使用數(shù)量。
　　2.動(dòng)物在體缺血再灌模型的制備及分組
　　大鼠

11、經(jīng)由氣管內(nèi)插管進(jìn)行輔助呼吸。采用左側(cè)開(kāi)胸術(shù)暴露心臟，對(duì)左側(cè)冠狀動(dòng)脈前降支進(jìn)行結(jié)扎造成缺血，然后松開(kāi)結(jié)扎恢復(fù)血流灌注。大鼠隨機(jī)分為四組:1）假性手術(shù)組:心臟適應(yīng)10min后，5-0絲線僅僅是穿過(guò)左冠脈前降支并沒(méi)有縫扎30min，然后去掉絲線，總體時(shí)間100min。2）缺血再灌注（I/R）組:心臟適應(yīng)10min后，5-0絲線縫扎左冠脈前降支30min，然后松開(kāi)絲線再恢復(fù)灌注60min。3）SK&F96365處理組:在I/R組的基礎(chǔ)上，在恢復(fù)

12、灌注的即刻靜脈注射0.06mg/kg SK&F96365。4）LOE908處理組（LOE908組）:在I/R組的基礎(chǔ)上，在恢復(fù)灌注的即刻靜脈注射0.1mg/kg LOE908。
　　3.各項(xiàng)指標(biāo)的觀察
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，留取大鼠頸動(dòng)脈血液，檢測(cè)其中的乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及內(nèi)皮素-1（ET-1）的含量。對(duì)再灌注結(jié)束的大鼠心臟，進(jìn)行TTC染色測(cè)定其中的梗死面積。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　

13、采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊則采用LSD方法，不齊則采用Dunntt-T3方法。 P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.鈣離子拮抗劑SK&F96365和LOE908對(duì)心肌組織酶學(xué)指標(biāo)的影響
　　大鼠心臟缺血再灌注后LDH(1356.33±186.75 U/L)和CK-MB(651.00±58.07

14、 U/L)均顯著性的增高(P=0.000)，表明模型成功。運(yùn)用SK&F96365和LOE908后，與I/R組相比，LDH（1077.00±119.26 U/L和1070.17±105.84 U/L）和CK-MB（529.00±51.80 U/L和517.50±112.95 U/L）均顯著降低(P=0.004和0.003)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.鈣離子拮抗劑SK&F96365和LOE908對(duì)血漿中內(nèi)皮素-1濃度的影響
　　大

15、鼠心臟缺血再灌注后，ET-1的含量（74.97±6.64 pg/ml）顯著增高(P=0.000)。而使用SK&F96365和LOE908后，ET-1的含量（57.88±6.54 pg/ml和62.85±6.03 pg/ml）均有著不同程度的降低，并且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000和0.002)?？梢?jiàn)SK&F96365和LOE908對(duì)ET-1有著抑制作用。
　　3.大鼠心臟梗死面積的變化
　　大鼠心臟缺血再灌注的措施增加了心肌

16、的梗死面積(48.00±2.60％)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。運(yùn)用SK&F96365(29.03±3.15％)和LOE908(30.80±2.83％)后，梗死面積有著顯著降低(P=0.000)。這和心肌酶學(xué)指標(biāo)的結(jié)果基本一致。
　　全文結(jié)論:
　　1.不同濃度的內(nèi)皮素-1對(duì)于缺血再灌注損傷模型的心肌有著不同的作用:低濃度內(nèi)皮素-1有著顯著的保護(hù)作用，而高濃度內(nèi)皮素-1所表現(xiàn)的強(qiáng)烈收縮血管的作用，對(duì)心肌產(chǎn)生一定的損傷