Testosterone抗心肌缺血復(fù)灌損傷的慢性與急性效應(yīng).pdf

1、目的： 大鼠雙側(cè)輸精管結(jié)扎,睪丸摘除,每天補(bǔ)充雄激素(200μg/100 g體重),建立雄激素替代療法模型.給藥8周后,大鼠開胸取心臟,I.angcndorff裝置上離體灌流,觀察睪酮替代療法的慢性心血管效應(yīng);在原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞模型上,MTI法測定細(xì)胞存活率.在分離細(xì)胞模型上,臺盼藍(lán)拒染法測定心肌細(xì)胞存活率,視頻跟蹤系統(tǒng)觀察單細(xì)胞收縮功能,測定線粒體膜電位和ROS生成情況;以線粒體上的多種通道/孔道為切入點(diǎn),利用多種工具藥

2、(阻斷劑/開放劑),深入研究睪酮急性心肌保護(hù)作用的具體機(jī)制. 方法： 1. 大鼠去勢模型和雄激素替代療法雄性Sprague-Dawley大鼠,體重(160～200)g,由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動物中心提供.大鼠麻醉后,用消毒過的刀片將陰囊處切開.輕輕拉出睪丸、附睪頭、附睪尾后,摘除睪丸;結(jié)扎輸精管并將其塞回陰囊.兩側(cè)相同處理.1周后,給藥組每天補(bǔ)充丙酸睪酮(200μg,100 g體重),去勢組給予相應(yīng)劑量溶媒. 2

3、. 離體心臟Langendorff灌流雄性SD大鼠斷頭后開胸迅速取出心臟,置于4℃改良Krebs-Henseleit(K-H)液中洗凈血液,迅速轉(zhuǎn)移、固定于Langendorff灌流裝置,以改良K-H液行常規(guī)恒壓(76mmHg)灌流.各組心臟均穩(wěn)定20 min后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理.結(jié)扎冠狀動脈使局部心肌缺血30 min,隨后松開結(jié)扎線復(fù)灌120 min. 3. 灌流心臟流出液乳酸脫氫酶活性的測定在復(fù)灌各時(shí)間點(diǎn)收集冠脈流出液,利用分光

4、光度法測定乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase,LDH)的含量. 4. 心肌梗死面積測定離體心臟復(fù)灌120 min后再結(jié)扎冠脈,取1﹪伊文思藍(lán)經(jīng)主動脈注入心臟,冷凍后與心臟縱軸垂直切成2mm均勻薄片,采用雙染色法染色,使用Image軟件(NIH)測量相關(guān)區(qū)域面積,計(jì)算梗死區(qū)占危險(xiǎn)區(qū)的比值. 5. 乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)取生后1-2d的SD大鼠心室肌,剪成1mm<'2>大小后,用含0.1﹪胰蛋白酶和0.05﹪膠原

5、酶Ⅱ的溶液(37℃)消化10 min,收集心肌細(xì)胞懸液,并用8 ml含15﹪胎牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)液中和胰酶作用.重復(fù)消化收集8-10次,直到心肌組織完全解離,以1200 rpm離心6 min,所得的沉淀用10 Inl DMEM(15﹪胎牛血清)重懸,然后置于二氧化碳培養(yǎng)箱(95﹪空氣+5﹪CO<,2>,37℃)中預(yù)培養(yǎng),1h后懸浮的心肌細(xì)胞用200目不銹鋼網(wǎng)過濾. 6. MTT法測定細(xì)胞存活率活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使

6、MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)分解產(chǎn)生藍(lán)色結(jié)晶狀formazan沉淀于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍.其量與細(xì)胞數(shù)呈正比,也與細(xì)胞活力呈正比. 7. 心室肌細(xì)胞分離及存活率測定用酶解法分離成年大鼠心室肌細(xì)胞.大鼠處死后,迅速取出心臟,置于4℃氧飽和Tyrode氏液中洗凈血液后固定于Langendorff灌流裝置上進(jìn)行恒流(10 ml/min)灌流(37℃).先以無鈣Trode氏液灌流5 min,再以含Ⅰ型膠

7、原酶0.3 g/L的無鈣Tyrode氏液灌流10mm.將心室肌剪碎,于含0.1﹪BSA的無鈣Tyrode氏液中37℃孵育15 min,細(xì)胞懸液用200μm的尼龍網(wǎng)過濾,濾液在無鈣Tyrode氏液中40 min內(nèi),每10 min一次逐步復(fù)鈣至Ca<'2+>濃度為1.25mmol/L.臺盼藍(lán)拒染法測定心肌細(xì)胞存活率.0.4﹪臺盼藍(lán)染色3 min后,死細(xì)胞藍(lán)染,活細(xì)胞不染色,顯微鏡下分別計(jì)算死細(xì)胞和活細(xì)胞個(gè)數(shù). 8. 線粒體膜電位和R

8、OS生成的測定分離的心肌細(xì)胞中加入相應(yīng)的熒光探針(TMRE測定膜電位,DcFH-DA測定.ROS生成量),常溫下避光孵育30 min,然后用Tyrode氏液沖洗2～3次,酶標(biāo)儀測定其熒光值改變量.將TMRE標(biāo)記的細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下選取合適的視野成像. 9. 單個(gè)心肌細(xì)胞收縮的測定將100μl細(xì)胞懸液滴于灌流槽中,以95﹪ O<,2>+5﹪CO<,2>飽和的k-H液持續(xù)灌流,流速為2ml/min.在灌流槽中施加頻率為0.2

9、Hz、強(qiáng)度為50 V的電場刺激,待細(xì)胞收縮穩(wěn)定15 min后,鏡下選擇橫紋清晰、胞膜光整的桿狀細(xì)胞,以計(jì)算機(jī)輔助的MedEase視頻跟蹤系統(tǒng)檢測單個(gè)心室肌細(xì)胞收縮參數(shù). 結(jié)果： 1.丙酸睪酮替代療法對大鼠體重及抗心肌缺血復(fù)灌損傷的慢性作用9周后,與正常對照組比較,去勢組大鼠體重顯著增加,丙酸睪酮(200μg/100 g體重,8周)處理后大鼠體重明顯下降.與去勢組相比,丙酸睪酮處理顯著地減少缺血復(fù)灌后心肌梗死面積和冠脈流出

10、液中LDH釋放量. 2. 睪酮對H<,2>O<,2>激引起的心肌細(xì)胞存活率的影響與正常組相比,100 μmol/L H<,2>O<,2>處理6 h后,心肌細(xì)胞MTT值顯著降低;睪酮預(yù)處理(10<'-5>μmol/L,10mm)能夠顯著增加心肌細(xì)胞MTT值. 3. 睪酮對H<,2>O<,2>應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞存活率的影響以及可能機(jī)制不同濃度的H202(10,100,1000 μmol/L.)均能引起心肌細(xì)胞存活率的降低,并

11、呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng).與正常細(xì)胞相比,100 μmoμ/L H<,2>O<,2>處理5 min后,臺盼藍(lán)染色法測定的心肌細(xì)胞存活率約降低56﹪.睪酮對心肌細(xì)胞存活率的作用存在劑量依賴效應(yīng).與H<,2>O<,2>組相比,睪酮(10<'-8>,10<'-7>,10<'-6>,10<'-5>,10<'-4>μmol/L)預(yù)處理10 min均顯著增加心肌細(xì)胞的存活率,而濃度為10<'-9>μmol/L的睪酮無顯著增加心肌細(xì)胞的存活率的作用.10<'

12、-5>μmol/L睪酮組增加心肌細(xì)胞的存活率的作用與10<'-4>μnol/L睪酮組有顯著差異,而與10<'-4>μmol/L,睪酮組無顯著差異.又根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們采用濃度為10<'-4>μnol/L的睪酮處理. H<,2>O<,2>應(yīng)激前加入線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放劑atractyloside(Atr,20μnol/L)預(yù)處理20 min或加入5-HI)(100 μmol/L)預(yù)處理10 min并于末10 min給予

13、睪酮(10<'-5>μnol/L)處理,均減小睪酮(10<'-5>μmol/L, 10 min)預(yù)處理增加心肌細(xì)胞存活率的作用. 4. 睪酮對H<,2>O<,2>應(yīng)激的心肌細(xì)胞線粒體TMRE熒光值的影響以及可能機(jī)制與對照組相比,H<,2>O<,2>應(yīng)激(10μmol/L)顯著地增加心肌細(xì)胞熒光值,睪酮(10<'-5>μmol/L)預(yù)處理能夠減少H<,2>O<,2>應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞熒光值△F增加. H<,2>O<,2>應(yīng)

14、激前加入(20μmol/L)預(yù)處理20 min或加入5-HD(100μmol/L)預(yù)處理10min并于末10 min給予睪酮(10<'-5>μmol/L)處理,均減小睪酮(10<'-5>μmol/L,10 min)預(yù)處理降低心肌細(xì)胞熒光值△F的作用. 5. 睪酮對H<,2>O<,2>應(yīng)激導(dǎo)致的ROS生成量變化的影響及可能機(jī)制與對照組相比,H<,2>O<,2>應(yīng)激組心肌細(xì)胞DCF熒光值顯著增加,睪酮(10<'-5>μmol/L)或

15、CsA(0.2μmol/L)預(yù)處理能夠減少H<,2>O<,2>應(yīng)激引起的心肌細(xì)胞DCF熒光值增加. H202應(yīng)激前加入Art(20μmol/L)預(yù)處理20 min或加入5-HD(100μmol/L)預(yù)處理10min并于末10 min給予睪酮(10<'-5>μmol/L)處理,均減小睪酮(10<'-5>μmol/L,10 min)預(yù)處理降低心肌細(xì)胞DCF熒光值的作用. 6. 睪酮預(yù)處理對H<,2>O<,2>應(yīng)激引起的心肌細(xì)

16、胞收縮動力學(xué)變化的影響與對照組相比,H<,2>O<,2>組的+dIJdtmax,-dL/dtmax和dL顯著降低.與H202組相比,睪酮預(yù)處理能顯著增加+dL/dtmax和dL;第2 min,顯著增加心肌細(xì)胞舒張速度-dL/dtmax,第4,8min沒有明顯變化,第6,10 min顯著增加心肌細(xì)胞舒張速度-dL/dtmax. Atr(20/μmol/L,20 min)預(yù)處理減小睪酮增加心肌細(xì)胞收縮速度+dL/dtmax的作用.

17、 結(jié)論： 睪酮具有慢性和急性的抗心肌缺血復(fù)灌損傷的心血管保護(hù)效應(yīng).丙酸睪酮替代療法顯著減少缺血復(fù)灌后心肌梗死面積和冠脈流出液中LDH釋放量;睪酮預(yù)處理顯著抑制H<,2>O<,2>應(yīng)激降低培養(yǎng)心肌細(xì)胞存活率的作用.在分離心肌細(xì)胞H<,2>O<,2>應(yīng)激模型上,睪酮預(yù)處理顯著增加心肌細(xì)胞存活率,抑制線粒體膜電位去極化和ROS生成,明顯改善H<,2>O<,2>應(yīng)激導(dǎo)致的+dL/dtmax和dL降低程度.睪酮的急性心肌保護(hù)作用可能