尼膜同對大鼠彌漫性軸索損傷后腦含水量、BBB通透性及AQP4表達的影響.pdf

1、目的：彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury，DAI)是一種常見的顱腦損傷類型，其特點是癥狀危重、昏迷時間長、傷殘率及死亡率高。DAI的形成包括一系列病理生理學變化過程，除了剪應力直接作用形成的原發(fā)性損傷外，腦損傷后的繼發(fā)性改變?nèi)缛毖?、缺氧、水腫等引起的損傷更為嚴重。伴隨DAI產(chǎn)生的血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)破壞，及由之引起的腦水腫等繼發(fā)性損傷是導致本病預后較差的主要原因。近年來發(fā)現(xiàn)的

2、水通道蛋白4(Aquaporin-4，AQP4)與DAI后腦水腫的形成關系密切，但AQP4是否引起B(yǎng)BB通透性的改變，以及Ca2+是否與二者有關聯(lián)尚不清楚。研究證明在大鼠腦出血模型中，Ca2+拮抗劑尼膜同能夠下調(diào)腦組織AQP4 mRNA表達，降低BBB通透性，從而抑制腦水腫。本實驗擬通過動態(tài)觀察大鼠DAI后腦組織含水量、BBB通透性和AQP4的表達，以及使用尼膜同后的變化，探討DAI后腦水腫的發(fā)生機制，從而為DAI防治提供理論依據(jù)。

3、 方法：健康雄性成年SD大鼠110只，體重350-375g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。按完全隨機分組原則分為3組：對照組、DAI組和尼膜同治療組。對照組10只，DAI組和尼膜同治療組各50只。后兩組再各隨機分為6h、1d、3d、5d、7d組5個亞組，每個亞組10只大鼠。DAI組按照Marmarou等的方法制作大鼠DAI模型；尼膜同治療組腹腔注射尼膜同(0.5mg/kg體重)20min后，按照Marmarou等的方法制作大鼠DA

4、I模型，以后每24h注射1次尼膜同(劑量同前)；對照組大鼠切開頭皮暴露顱骨后直接縫合。造模后大鼠常規(guī)進食。從DAI組和尼膜同治療組每個亞組中隨機抽取五只大鼠，連同從對照組中隨機抽取的五只大鼠，按預定時間，4％多聚甲醛溶液灌注后斷頭取腦，沿正中矢狀線將腦組織分為左右兩部分。左半腦組織立即進行腦組織含水量的測定；右半腦組織常規(guī)固定、脫水、透明、石蠟包埋后連續(xù)切片厚度4μm，進行相應染色、觀察。取上述各時間點的左半腦組織，采用干濕重法計算腦組

5、織含水量，以此代表腦水腫的程度。 各組中剩余的大鼠均采用分光光度法檢測各時間點的腦組織中伊文思蘭(evens blue，EB)的含量，以定量評價BBB功能損害的情況。 在光鏡下，通過對標本的HE染色觀察DAI后腦水腫的變化，如細胞水腫、細胞間隙和血管周圍間隙增寬程度等。通過對標本的免疫組化染色觀察細胞胞膜呈棕黃色或褐色深染的AQP4蛋白陽性表達。采用Motic6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)定量分析每個視野陽性目標平均吸光度值

6、(OD)，代表AQP4的表達強度。 應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件，所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示。兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，當方差分析有顯著性差異時，進一步用q檢驗作兩兩比較；以及根據(jù)實驗要求作直線相關性分析。以P＜0.05作為判斷差異有無統(tǒng)計學意義的標準。 結(jié)果： 1.肉眼及光鏡觀察結(jié)果肉眼觀察：DAI組和尼膜同治療組可見軟腦膜血管擴張淤血，散在的點灶狀蛛網(wǎng)膜下腔出血，

7、未見明顯的腦挫傷及腦實質(zhì)內(nèi)出血；HE染色：DAI組可見腦組織疏松水腫，細胞空泡樣變，細胞間隙和血管周圍間隙增寬。尼膜同治療組病理變化較DAI組輕。對照組無上述病理變化；免疫組化染色：DAI組可見室管膜、軟腦膜和血管周圍的星形膠質(zhì)細胞胞膜呈棕黃色或褐色深染的AQP4陽性表達。尼膜同治療組AQP4表達較DAI組稍弱，但強于對照組。對照組AQP4呈弱陽性表達。 2.腦組織含水量的變化DAI組和尼膜同治療組腦組織含水量均呈現(xiàn)一個由低向高

8、，到達頂峰后逐漸降低的過程。從致傷后6h開始增加，1d達到高峰，之后開始下降，7d腦組織含水量仍高于正常。與對照組比較，DAI組和尼膜同治療組都具有統(tǒng)計學差別(P＜0.05)。尼膜同治療組達到高峰時間與DAI組相同，但6h、1d、3d、5d腦組織含水量均低于DAI組(P＜0.05)，7d腦組織含水量無明顯差異(P＞0.05)。 3.BBB通透性的變化(EB含量的變化)DAI組和尼膜同治療組BBB通透性均呈現(xiàn)一個逐漸上升，到達頂峰

9、后緩慢降低的過程。從致傷后6h開始升高，1d～3d時最高(1d與3d比較無明顯差異)，之后逐漸降低，7天BBB通透性仍高于正常。與對照組比較，DAI組和尼膜同治療組都具有統(tǒng)計學差別(P＜0.05)。尼膜同治療組的變化與DAI組相似，但各對應時間點BBB通透性均低于DAI組(P＜0.05)。 4 腦組織AQP4表達的變化DAI組和尼膜同治療組腦組織AQP4表達均呈現(xiàn)一個由低向高，到達頂峰后逐漸降低的過程。從致傷后6h開始增加，3d

10、達到高峰，之后開始下降，7d腦組織AOP4表達仍高于正常。與對照組比較，DAI組和尼膜同治療組都具有統(tǒng)計學差別(P＜0.05)。尼膜同治療組達到高峰時間與DAI組相同，但各對應時間點AQP4表達均低于DAI組(P＜0.05)。 5 腦含水量、EB含量、AQP4表達的相關分析大鼠DAI后腦含水量、EB含量與AQP4表達的變化規(guī)律一致，相關分析顯示腦含水量與AQP4表達正相關(r=0.824，P＜0.01)；EB含量與AQP4表達也

11、呈正相關(r=0.871，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.大鼠DAI后腦組織含水量、BBB通透性、AQP4表達均呈現(xiàn)一個由低向高，到達頂峰后開始逐漸降低的過程。AQP4蛋白的變化規(guī)律，與腦組織含水量、BBB通透性呈正相關，證實AQP4與DAI后腦水腫的形成，BBB損傷之間存在密切正相關關系。 2.給予尼膜同治療后，與DAI組相比，腦組織含水量、BBB通透性、AQP4表達在各對應時間點均有明顯的差異(P＜0.05)。