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文檔簡介
1、目的:彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury,DAI)是指在頭部遭受直線加速性或(和)旋轉(zhuǎn)性暴力打擊時,腦組織由于加速運動而產(chǎn)生剪切、伸展和壓縮應(yīng)力,導(dǎo)致腦白質(zhì)廣泛發(fā)生以神經(jīng)軸索損傷為特征的一系列病理生理變化。意識障礙是其典型的表現(xiàn),臨床診斷較困難,預(yù)后多差。近年來研究發(fā)現(xiàn),彌漫性軸索損傷造成外傷后的腦功能障礙不僅是由于最初的機械外力對組織的剪切、積壓等造成的,更是由于損傷后數(shù)小時甚至數(shù)天中發(fā)生的復(fù)雜的“二次打擊”造
2、成的。以往的研究主要集中在損傷后神經(jīng)元的變化,近年有研究發(fā)現(xiàn)外傷性腦損傷(traumic brain injury,TBI)后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞增生,且隨時間的變化而變化。 小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫效應(yīng)細胞,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。小膠質(zhì)細胞也是一種可塑性細胞,不僅能釋放神經(jīng)生長因子,也能釋放神經(jīng)毒因子,其保護作用和損傷神經(jīng)元的效應(yīng)依賴于周圍環(huán)境及活化因子的變化。有實驗表明,小膠質(zhì)細
3、胞是第一個針對損傷發(fā)生應(yīng)答的細胞。在短暫性前腦缺血模型中,發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞的反應(yīng)早在20分鐘內(nèi)即發(fā)生。外傷性腦損傷后有IL-6、IL-10、IL-1、IFN-γ等炎性細胞因子表達增高,且其血漿含量可作為反映傷情嚴重程度的可靠指標。IL-6在創(chuàng)傷性炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用,屬于致傷因子,具有啟動和促進炎癥反應(yīng)的作用,與損傷的嚴重程度密切相關(guān)。然而,小膠質(zhì)細胞是否在DAI后被激活,是否與促炎因子IL-6一起參與了二次打擊的過程,從
4、而導(dǎo)致其自身及神經(jīng)元的進一步損傷目前尚不清楚。本實驗采用Marmarou A等人于1994年首次報道的自由落體撞擊方法復(fù)制大鼠DAI模型,觀察小膠質(zhì)細胞是否在DAI后被激活,促炎因子IL-6的表達情況,進一步探討DAI后的神經(jīng)組織中神經(jīng)元和小膠質(zhì)細胞的相互作用,及損傷后炎癥反應(yīng)和細胞損傷的關(guān)系,為進一步闡明DAI的病理生理學(xué)機制奠定基礎(chǔ)。 方法:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只,體重300克左右,隨機分為正
5、常對照組、假手術(shù)組和打擊后不同時間組(0h、1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、5d和7d)。正常對照組大鼠不作處理;假手術(shù)組大鼠給予手術(shù)及打擊前處理,但不予真正的打擊;打擊組大鼠經(jīng)過手術(shù)后,給予打擊,打擊后按不同時間處死。觀察打擊后大鼠的行為學(xué)表現(xiàn),麻醉灌注后取全腦,制作石蠟切片,采用HE染色、銀染、焦油紫尼氏小體染色和Weil’s鐵蘇木素髓鞘染色的方法觀察大鼠腦組織的病理改變。將經(jīng)以上方法驗證符合標準的大鼠列入打擊組,
6、用免疫組織化學(xué)的方法測定腦組織中各個腦區(qū)小膠質(zhì)細胞激活標志物CD11b及IL-6在損傷后不同時間點的表達情況。 計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(Mean±SD)表示,用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA),用最小顯著差法(LSD)作兩兩比較,P<0.05為有顯著性差異。結(jié)果:1 組織病理學(xué)變化: HE染色形態(tài)學(xué)變化:正常對照組與假手術(shù)對照組的大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰,均勻致密;打擊組大鼠
7、大腦皮層、腦干等部位可見局灶性點狀出血,大鼠打擊后6h開始出現(xiàn)腦組織充血水腫,24h達高峰,48h以后腫脹有所減輕。 Bielschowsky's鍍銀染色軸索的形態(tài)學(xué)變化:正常對照組與假手術(shù)對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰,神經(jīng)元軸突直且長,表面光滑;打擊組大鼠打擊后12h可見胼胝體、腦干和小腦等部位神經(jīng)軸索扭曲、腫脹,呈串珠狀、波浪狀改變,周圍間質(zhì)水腫,上述表現(xiàn)于24h及48h更加明顯,5d明顯好轉(zhuǎn)。 Weil's髓鞘染色髓鞘
8、的形態(tài)學(xué)變化:正常對照組與假手術(shù)對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰,均勻致密,髓鞘橫切面呈環(huán)狀,縱切面呈魚刺狀;打擊組大鼠打擊后6h可見大鼠腦干等部位損傷軸索的周圍髓鞘間隙明顯增寬,髓鞘顯著疏松、水腫及崩解出現(xiàn)空白區(qū),上述改變在12h、24h和48h更加明顯,5d明顯好轉(zhuǎn)。 Cresyl violet染色神經(jīng)元尼氏小體的形態(tài)學(xué)變化:正常對照組與假手術(shù)對照組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)清晰,腦干、皮質(zhì)和小腦等部位神經(jīng)元內(nèi)可見呈藍紫色,細小顆粒狀,均勻致密
9、,環(huán)繞在細胞核的周圍的尼氏小體;打擊組大鼠打擊12h后可見腦干等部位損傷軸索的周圍神經(jīng)元淡染出現(xiàn)空白區(qū),尼氏小體明顯減少,且呈粗大顆粒狀,上述改變在24h和48h顯著,5d明顯好轉(zhuǎn)。 2.CD11b陽性小膠質(zhì)細胞在不同時間點的活化:正常對照組與假手術(shù)對照組大鼠腦組織CD11b陽性小膠質(zhì)細胞淡染,呈棕黃色、分枝狀,胞體小,具有伸向各個方向的細小突起;打擊組大鼠打擊后3h可見皮層、小腦、腦干等腦區(qū)的小膠質(zhì)細胞CD11b表達升高,主要
10、分布于損傷軸索及小血管的周圍,且與對照組有明顯差異(P<0.05),其表達量12h時增高達到峰值,活化的小膠質(zhì)細胞數(shù)量明顯增加,突起變短、變粗,胞體增大、變圓,CD11b表達于24h后開始下降,72h后明顯低于12h組,但與對照組仍然有明顯的差異(P<0.05)。 3 DAI后IL-6在不同時間點的表達:正常對照組與假手術(shù)對照組大鼠的腦組織IL-6有表達,其量很低;打擊組大鼠打擊后6h可見皮層、小腦、腦干等損傷部位腦區(qū)神經(jīng)細胞有IL-6
11、表達的升高,與對照組有明顯差異(P<0.05),12h至24h表達量增高達到峰值,48h其表達開始下降,7d時IL-6的表達較24h有非常明顯的降低,但較對照組仍然有明顯的差異(P<0.05),陽性細胞主要是神經(jīng)膠質(zhì)細胞,神經(jīng)元也有一定量IL-6的表達。 結(jié)論:采用Marmarou A的自由落體撞擊方法復(fù)制了大鼠彌漫性軸索損傷模型;DAI后腦組織中CD11b陽性小膠質(zhì)細胞活化,12h達到峰值;DAI后大鼠腦組織中IL-6的表達升
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