窒息法心肺腦復(fù)蘇大鼠腦組織含水量和AQP4表達(dá)水平相關(guān)性研究.pdf

1、目的： 在心肺腦復(fù)蘇(Cardiopulmonary cerebral Resuscitation CPCR)過(guò)程中，腦水腫(cerebral edema)的發(fā)生對(duì)于復(fù)蘇的預(yù)后進(jìn)展有著非常重要的作用，研究在心肺復(fù)蘇過(guò)程中引起腦水腫的因素從而顯得非常重要。各種原因所致呼吸循環(huán)驟停均可引起腦水腫，重者危及生命。對(duì)其治療主要局限于滲透性利尿或外科減壓，尚少針對(duì)腦水腫形成機(jī)制方面的治療。新近有研究顯示，水通道蛋白(aquaporin A

2、QP)是大腦水轉(zhuǎn)運(yùn)的一個(gè)重要途徑，它可能參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中腦水腫的形成。水通道蛋白是對(duì)水專(zhuān)一的通道蛋白，普遍存在于動(dòng)物植物和微生物中。它所介導(dǎo)的自由水快速被動(dòng)的跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)，是水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑。大腦中表達(dá)的水通道蛋白主要是AQP1和AQP4，其中AQP4更為重要。已經(jīng)有研究證明，AQP4參與了包括腦創(chuàng)傷、腦梗塞、水中毒、腦出血等疾病的腦水腫形成。但是，對(duì)于A(yíng)QP4在心肺腦復(fù)蘇中腦水腫中的表達(dá)和作用，目前還缺乏研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立

3、大鼠心跳呼吸驟停模型，并且進(jìn)行正規(guī)的心肺腦復(fù)蘇操作，然后根據(jù)復(fù)蘇結(jié)果的不同，切取腦組織測(cè)量其腦組織含水量，并且進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和免疫印跡技術(shù)檢測(cè)，通過(guò)圖像軟件分析不同復(fù)蘇結(jié)果的大鼠腦組織中的AQP-4的表達(dá)，以及進(jìn)行腦組織含水量并且進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和處理，比較不同復(fù)蘇結(jié)果下腦組織含水量的不同情況，以及不同情況下腦組織中AQP-4的表達(dá)與腦組織含水量的關(guān)系，從而分析其在心肺腦復(fù)蘇中的可能作用，為心肺腦復(fù)蘇的分子水平研究，提供一個(gè)新的思路

4、。 研究對(duì)象與方法： 1、動(dòng)物模型制作通過(guò)采用夾閉氣管窒息的方法，建立大鼠心跳呼吸驟停模型，并且進(jìn)行心肺腦復(fù)蘇操作，包括體外心臟按壓，呼吸機(jī)輔助通氣。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，根據(jù)不同組別(復(fù)蘇成功組，復(fù)蘇失敗組，正常對(duì)照組)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)菌手術(shù)切取腦組織，測(cè)定腦組織含水量，多聚甲醛固定腦組織，和液氮冷凍，送檢標(biāo)本。 2、腦組織含水量測(cè)定對(duì)于不同組別的大鼠，活體經(jīng)心臟快速灌注4℃生理鹽水250ml至右房流出液變清，迅速斷頭取

5、腦。取左半腦，用電子天平稱(chēng)量濕重，80℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)烘烤72h，稱(chēng)取干重，計(jì)算腦組織含水量：BWC=[(濕重一千重)/濕重]X100％。 3、免疫組化檢測(cè)使用免疫組化S-P法，對(duì)切取固定的標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)浸蠟，制作出蠟塊，并且進(jìn)行常規(guī)切片，組織材料脫蠟及水化；抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS洗滌切片；抗原修復(fù)，先后滴加一抗和二抗，滴加S-P試劑，制作切片。倒置顯微鏡觀(guān)察AQP-4的表達(dá)。使用Imagepro-plus 6.0圖像

6、分析軟件進(jìn)行平均光密度檢測(cè)。 4、免疫印痕技術(shù)技術(shù)檢測(cè)將取出的腦組織，以無(wú)菌pvc管內(nèi)液氮冷凍，-70℃冰箱保存待測(cè)，預(yù)冷裂解后，超聲粉碎，離心，沉淀加入溶膜緩沖液，超聲混勻，冰上孵育過(guò)夜后離心，取上清分裝，酚試劑法測(cè)定其蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。采用酚試劑法定量蛋白，檢測(cè)腦組織中的AQP-4含量。 5、數(shù)據(jù)處理 利用ChemiImager 5500 V2.03圖象分析軟件對(duì)western實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析

7、。用spss13.0軟件包對(duì)于不同組別的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，采用p<0.05作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。如果差異具有顯著性，則進(jìn)行LSD法檢驗(yàn)(t檢驗(yàn)完成值之間的兩兩檢驗(yàn))，仍然以p<0.05作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。用spss13.0軟件包進(jìn)行處理。對(duì)于腦組織含水量和AQP4的westren數(shù)據(jù)表達(dá)值，采用直線(xiàn)相關(guān)分析，以p<0.05作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生命體征情況心肺復(fù)蘇各組大鼠窒

8、息至開(kāi)始心肺復(fù)蘇的指標(biāo)一致，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示其差別不具有顯著性(p>0.05)，提示自主循環(huán)恢復(fù)之前復(fù)蘇各組大鼠所遭受到的缺血缺氧性損害程度是基本相同的。 2、腦組織含水量測(cè)定結(jié)果對(duì)于復(fù)蘇成功組和對(duì)照組，其腦組織含水量(％)(成功組77.72±0.24，對(duì)照組77.74±0.08)差異不具有顯著性(p>0.05)，對(duì)于復(fù)蘇成功組(77.72±0.24)和失敗組(80.51±0.35)之間，以及復(fù)蘇失敗組(80.51±0.35)

9、和對(duì)照組(77.74±0.08)之間，其差異具有顯著性(p<0.05)。 3、免疫組化結(jié)果通過(guò)免疫組化，倒置顯微鏡鏡下觀(guān)察到AQP4在心肺腦大鼠中，其在復(fù)蘇成功組和對(duì)照組中的表達(dá)相類(lèi)似，此二者的表達(dá)明顯少于在復(fù)蘇失敗組中的表達(dá)。而通過(guò)圖像分析系統(tǒng)也提示此二者表達(dá)明顯少于在復(fù)蘇失敗組中的表達(dá)。 4、免疫印痕技術(shù)結(jié)果通過(guò)免疫印痕技術(shù)分析，獲得其灰度值后，進(jìn)行方差分析，提示存在組間差異(F=246．672 p<0.05)，比較

10、不同組別問(wèn)的差異，通過(guò)LSD統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，AQP4的在復(fù)蘇成功組中的表達(dá)明顯少于復(fù)蘇失敗組(p<0.05)，而與對(duì)照組(正常健康大鼠)的表達(dá)類(lèi)似(p=0.702>0.05)。 5、腦組織含水量和腦組織AQP4表達(dá)的相關(guān)性分析二者之間通過(guò)相關(guān)性分析，可以發(fā)現(xiàn)此二者存在相關(guān)關(guān)系(K=1.54b=20.52 r=0.872 p<0.05) 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1、腦組織含水量檢測(cè)證實(shí)復(fù)蘇失敗組的腦組織含水量明顯高于正常對(duì)照組

11、和復(fù)蘇成功組，其差異具有顯著性，提示復(fù)蘇失敗大鼠的腦水腫比較明顯。 2、免疫組化的結(jié)果可以看出，心肺腦復(fù)蘇成功組的大鼠的腦組織中，AQP4的表達(dá)不明顯，與正常對(duì)照組(正常健康大鼠)的表達(dá)類(lèi)似，而在復(fù)蘇失敗組的大鼠中，其表達(dá)非常明顯。對(duì)于圖像分析系統(tǒng)的平均光密度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示復(fù)蘇成功組與失敗組之間，對(duì)照組和失敗組之間AQP4表達(dá)差異存在顯著性(p<0.05)，而復(fù)蘇成功組和對(duì)照組之間差異不具有顯著性(p>0.05)。

12、 3、免疫印跡技術(shù)的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了上述結(jié)論，水通道蛋白-4在心肺腦復(fù)蘇中在失敗的病例中表達(dá)明顯，而在復(fù)蘇成功和正常對(duì)照組中的表達(dá)不明顯。 4、腦組織含水量測(cè)定和腦組織AQP4的表達(dá)水平相關(guān)性結(jié)果表明，二者之間存在相關(guān)關(guān)系，呈現(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)，即在腦組織含水量增加時(shí)，AQP4的表達(dá)水平也隨之上升，說(shuō)明腦水腫可能是AQP4的表達(dá)所引起。 結(jié)論：AQP4在心肺腦復(fù)蘇失敗大鼠腦組織中表達(dá)明顯，與腦水腫程度正相關(guān)提示AQP4在心肺腦