窒息法心肺腦復蘇大鼠腦組織含水量和AQP4表達水平相關性研究.pdf

1、目的： 在心肺腦復蘇(Cardiopulmonary cerebral Resuscitation CPCR)過程中，腦水腫(cerebral edema)的發(fā)生對于復蘇的預后進展有著非常重要的作用，研究在心肺復蘇過程中引起腦水腫的因素從而顯得非常重要。各種原因所致呼吸循環(huán)驟停均可引起腦水腫，重者危及生命。對其治療主要局限于滲透性利尿或外科減壓，尚少針對腦水腫形成機制方面的治療。新近有研究顯示，水通道蛋白(aquaporin A

2、QP)是大腦水轉運的一個重要途徑，它可能參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中腦水腫的形成。水通道蛋白是對水專一的通道蛋白，普遍存在于動物植物和微生物中。它所介導的自由水快速被動的跨生物膜轉運，是水進出細胞的主要途徑。大腦中表達的水通道蛋白主要是AQP1和AQP4，其中AQP4更為重要。已經(jīng)有研究證明，AQP4參與了包括腦創(chuàng)傷、腦梗塞、水中毒、腦出血等疾病的腦水腫形成。但是，對于AQP4在心肺腦復蘇中腦水腫中的表達和作用，目前還缺乏研究。本實驗通過建立

3、大鼠心跳呼吸驟停模型，并且進行正規(guī)的心肺腦復蘇操作，然后根據(jù)復蘇結果的不同，切取腦組織測量其腦組織含水量，并且進行免疫組織化學染色和免疫印跡技術檢測，通過圖像軟件分析不同復蘇結果的大鼠腦組織中的AQP-4的表達，以及進行腦組織含水量并且進行統(tǒng)計學分析和處理，比較不同復蘇結果下腦組織含水量的不同情況，以及不同情況下腦組織中AQP-4的表達與腦組織含水量的關系，從而分析其在心肺腦復蘇中的可能作用，為心肺腦復蘇的分子水平研究，提供一個新的思路

4、。 研究對象與方法： 1、動物模型制作通過采用夾閉氣管窒息的方法，建立大鼠心跳呼吸驟停模型，并且進行心肺腦復蘇操作，包括體外心臟按壓，呼吸機輔助通氣。在實驗結束后，根據(jù)不同組別(復蘇成功組，復蘇失敗組，正常對照組)，對實驗動物無菌手術切取腦組織，測定腦組織含水量，多聚甲醛固定腦組織，和液氮冷凍，送檢標本。 2、腦組織含水量測定對于不同組別的大鼠，活體經(jīng)心臟快速灌注4℃生理鹽水250ml至右房流出液變清，迅速斷頭取

5、腦。取左半腦，用電子天平稱量濕重，80℃電熱恒溫干燥箱內烘烤72h，稱取干重，計算腦組織含水量：BWC=[(濕重一千重)/濕重]X100％。 3、免疫組化檢測使用免疫組化S-P法，對切取固定的標本進行常規(guī)浸蠟，制作出蠟塊，并且進行常規(guī)切片，組織材料脫蠟及水化；抑制內源性過氧化物酶活性，PBS洗滌切片；抗原修復，先后滴加一抗和二抗，滴加S-P試劑，制作切片。倒置顯微鏡觀察AQP-4的表達。使用Imagepro-plus 6.0圖像

6、分析軟件進行平均光密度檢測。 4、免疫印痕技術技術檢測將取出的腦組織，以無菌pvc管內液氮冷凍，-70℃冰箱保存待測，預冷裂解后，超聲粉碎，離心，沉淀加入溶膜緩沖液，超聲混勻，冰上孵育過夜后離心，取上清分裝，酚試劑法測定其蛋白濃度，以牛血清白蛋白為標準品。采用酚試劑法定量蛋白，檢測腦組織中的AQP-4含量。 5、數(shù)據(jù)處理 利用ChemiImager 5500 V2.03圖象分析軟件對western實驗結果進行分析

7、。用spss13.0軟件包對于不同組別的實驗數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，采用p<0.05作為差異具有顯著性的標準。如果差異具有顯著性，則進行LSD法檢驗(t檢驗完成值之間的兩兩檢驗)，仍然以p<0.05作為差異具有顯著性的標準。用spss13.0軟件包進行處理。對于腦組織含水量和AQP4的westren數(shù)據(jù)表達值，采用直線相關分析，以p<0.05作為差異顯著性標準。 實驗結果： 1、實驗動物的生命體征情況心肺復蘇各組大鼠窒

8、息至開始心肺復蘇的指標一致，經(jīng)過統(tǒng)計學分析提示其差別不具有顯著性(p>0.05)，提示自主循環(huán)恢復之前復蘇各組大鼠所遭受到的缺血缺氧性損害程度是基本相同的。 2、腦組織含水量測定結果對于復蘇成功組和對照組，其腦組織含水量(％)(成功組77.72±0.24，對照組77.74±0.08)差異不具有顯著性(p>0.05)，對于復蘇成功組(77.72±0.24)和失敗組(80.51±0.35)之間，以及復蘇失敗組(80.51±0.35)

9、和對照組(77.74±0.08)之間，其差異具有顯著性(p<0.05)。 3、免疫組化結果通過免疫組化，倒置顯微鏡鏡下觀察到AQP4在心肺腦大鼠中，其在復蘇成功組和對照組中的表達相類似，此二者的表達明顯少于在復蘇失敗組中的表達。而通過圖像分析系統(tǒng)也提示此二者表達明顯少于在復蘇失敗組中的表達。 4、免疫印痕技術結果通過免疫印痕技術分析，獲得其灰度值后，進行方差分析，提示存在組間差異(F=246．672 p<0.05)，比較

10、不同組別問的差異，通過LSD統(tǒng)計學分析表明，AQP4的在復蘇成功組中的表達明顯少于復蘇失敗組(p<0.05)，而與對照組(正常健康大鼠)的表達類似(p=0.702>0.05)。 5、腦組織含水量和腦組織AQP4表達的相關性分析二者之間通過相關性分析，可以發(fā)現(xiàn)此二者存在相關關系(K=1.54b=20.52 r=0.872 p<0.05) 實驗結論： 1、腦組織含水量檢測證實復蘇失敗組的腦組織含水量明顯高于正常對照組

11、和復蘇成功組，其差異具有顯著性，提示復蘇失敗大鼠的腦水腫比較明顯。 2、免疫組化的結果可以看出，心肺腦復蘇成功組的大鼠的腦組織中，AQP4的表達不明顯，與正常對照組(正常健康大鼠)的表達類似，而在復蘇失敗組的大鼠中，其表達非常明顯。對于圖像分析系統(tǒng)的平均光密度值，進行統(tǒng)計學分析提示復蘇成功組與失敗組之間，對照組和失敗組之間AQP4表達差異存在顯著性(p<0.05)，而復蘇成功組和對照組之間差異不具有顯著性(p>0.05)。

12、 3、免疫印跡技術的結果進一步證實了上述結論，水通道蛋白-4在心肺腦復蘇中在失敗的病例中表達明顯，而在復蘇成功和正常對照組中的表達不明顯。 4、腦組織含水量測定和腦組織AQP4的表達水平相關性結果表明，二者之間存在相關關系，呈現(xiàn)線性相關，即在腦組織含水量增加時，AQP4的表達水平也隨之上升，說明腦水腫可能是AQP4的表達所引起。 結論：AQP4在心肺腦復蘇失敗大鼠腦組織中表達明顯，與腦水腫程度正相關提示AQP4在心肺腦