P16基因沉默及對人毛乳頭細胞的影響.pdf

1、目的:基因沉默(Gene Silencing)是真核生物細胞基因表達調(diào)節(jié)的一種手段?；虺聊卸喾N方法，RNA干擾（RNA interference，RNAi）現(xiàn)象是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，即由內(nèi)源性或外源性同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的目的mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。人毛乳頭細胞(dermal papilla cells，DPCs)是一簇間充質(zhì)細胞位于毛囊基底部，也是一種特化的成纖維細胞，

2、其對毛囊的誘導(dǎo)和分化有重要作用。研究表明毛乳頭細胞這種作用與其在體內(nèi)外成特征性凝集性生長有密切的關(guān)系，體外實驗證明，毛乳頭細胞會隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸失去其凝集性生長的特性，細胞傳代至7、8、9代時這種特征性的凝集性生長基本消失，隨著此特性消失，毛乳頭細胞對毛囊形態(tài)學(xué)的影響及生長周期的調(diào)控作用也逐漸消失，從而導(dǎo)致了斑禿等毛發(fā)疾病的發(fā)生。P16基因為細胞周期調(diào)控因子，其主要通過抑制細胞周期蛋白激酶4(cyclindependent ki

3、nase，CDK4)而發(fā)揮作用，主要功能使細胞周期從G1期進入S期受阻，從而對細胞周期進行調(diào)控。有研究發(fā)現(xiàn)，高傳代的毛乳頭細胞中P16蛋白的表達量較低傳代的毛乳頭細胞中高，P16基因可能與細胞衰老有關(guān)。毛乳頭細胞高傳代時失去其特征性的凝集性生長，細胞周期延長，P16蛋白表達量增加，考慮將將P16基因沉默后，毛乳頭細胞能否延遲衰老，或恢復(fù)其特征性凝集性生長，從而恢復(fù)對毛囊的調(diào)控作用，為毛發(fā)疾病，特別是斑禿的治療提供新的方法？
　　方

4、法:
　　1實驗分組
　　將購得的人毛乳頭細胞隨機分為三組，分別為基因沉默組、陰性對照組和正常組。
　　2人毛乳頭細胞的RNA干擾。
　　將復(fù)蘇后的毛乳頭細胞培養(yǎng)于專用MSCM培養(yǎng)基中，并置于37℃、適宜濕度、5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。待細胞融合率達60％-70％后，根據(jù)預(yù)實驗，于基因沉默組和陰性對照組細胞中分別加入含有適量的病毒顆粒的無血清培養(yǎng)基，4小時后，更換為MSCM培養(yǎng)基，待溫箱內(nèi)放置48小時后，

5、于熒光顯微鏡下觀察人毛乳頭細胞的細胞轉(zhuǎn)染率。
　　3倒置相差顯微及電鏡下觀察，不同組細胞的細胞形態(tài)及生長狀態(tài)的不同。
　　4 MTT法測不同組細胞的生長曲線。
　　5 PCR方法檢測不同組細胞P16基因mRNA的表達量，內(nèi)參照為甘油醛-3磷酸脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)。
　　6用免疫熒光法及流式細胞儀檢測不同組細胞的P16蛋白的表達異。

6、
　　7流式細胞儀測定基因沉默后不同組細胞的細胞周期及凋亡。
　　8運用統(tǒng)計軟件SPSS13.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和處理。
　　結(jié)果:
　　1細胞轉(zhuǎn)染效率大約為70％-80％，符合實驗要求(Fig.2-2)。
　　2倒置相差顯微鏡及電鏡下觀察，P16基因沉默組及陰性對照組較正常組有較多的核分裂，及細胞表面的顆粒樣物質(zhì)(Fig.2-3、Fig.2-4)。
　　3 MTT法測定不同時間不同組細胞吸光度值改

7、變，從而繪制出各組細胞的生長曲線，結(jié)果（Fig.2-5、Table2-3）正常組第1-5天的吸光度分別為0.196±0.030、0.266±0.048、0、325±0.027、0.369±0.045、0.465±0.057;陰性對照組為0.164±0.039、0.283±0.063、0.314±0.064、0.406±0.075、0.437±0.070;基因沉默組為0.206±0.047、0.253±0.033、0.359±0.081、

8、0.519±0.079、0.536±0.052。
　　4普通PCR結(jié)果顯示內(nèi)參照組的亮度基本相同，實驗組基因沉默組的亮度明顯暗于陰性對照組和基因沉默組(Fig.2-7)，Q-PCR結(jié)果顯示表示P16基因mRNA的含量的RQ值基因沉默組為0.04±0.007;陰性對照組為0.66±0.356;正常組為1(Fig.2-8、Table2-2)。
　　5免疫熒光法測定不同組細胞P16蛋白表達量結(jié)果顯示基因沉默組熒光量最弱，陰性對照組

9、熒光量與正常組熒光量比基因沉默組強(Fig.2-10)。
　　6流式細胞儀測定3組細胞P16蛋白表達量結(jié)果為，所得到的FI值基因沉默組4代細胞為2.43±0.02，8代細胞為2.04±0.06;陰性對照組4代細胞為2.25±0.03，8代細胞為1.91±0.07;基因沉默組4代細胞為1.27±0.31，8代細胞為1.2±0.05(Fig.2-10、Table2-4)。
　　7流式細胞儀測定3組細胞的細胞周期及凋亡率，測定細胞

10、凋亡率結(jié)果為基因沉默組為8.92±0.61，陰性對照組為4.35±0.05，正常組為2.86±0.07;測定細胞周期時G1％基因沉默組為57.8±4.38，陰性對照組為68±1.27，正常組為82.1±0.99;S％含量基因沉默組為45.1±1.27;陰性對照組為26.7±0.71，正常組為8.6±4.45(Fig.2-11、Table2-5)。
　　結(jié)論:
　　1 P16基因可能通過細胞周期的調(diào)節(jié)，抑制細胞的生長。