松花粉對衰老人胚肺成纖維細胞p16及p21基因表達的影響.pdf

1、研究背景：老齡化社會的到來使老年相關(guān)性疾病越來越受到關(guān)注。有觀點認為預(yù)防老年相關(guān)性疾病的一個重要方法即延緩機體“衰老”的發(fā)生。因此，延緩機體衰老有利于改善老年人的健康素質(zhì)，有利于降低老年性疾病的發(fā)病率和惡性程度，有利于減少社會老年性疾病的治療成本。 自Hayflick等提出了細胞復(fù)制性衰老的假說以來。大量的實驗研究證實，衰老細胞的復(fù)制受限是一種受體內(nèi)衰老相關(guān)的多組基因調(diào)控的內(nèi)在機制，它們主要是一組與癌癥相關(guān)的組抑癌基因，包括p5

2、3，pRB，p16INK4A和p21CIP-1等。 早期的研究證明衰老的誘發(fā)因素可分為端粒與非端粒性誘發(fā)因素。目前觀點認為端?？s短誘發(fā)衰老與激活了衰老相關(guān)p53-p21通路有關(guān)，誘發(fā)衰老的非端粒性因素：包括自由基、線粒體DNA損傷、放射線損傷等均與細胞結(jié)構(gòu)性損傷在胞內(nèi)蓄積有關(guān)，其誘發(fā)衰老具有一條共同的下游通路，即p16—pRb通路。 衰老理論的創(chuàng)新為抗衰老藥物的篩選和藥效研究提供了有力的依據(jù)。目前抗衰老藥物的篩選研究也主

3、要通過抑制細胞的衰老表觀改變，改善衰老誘發(fā)因素的負效應(yīng)和調(diào)控衰老相關(guān)基因的表達來驗證其衰老效果。 大批中藥材在古代醫(yī)典中記載著具有延年、益壽之效，如何將具有延緩衰老作用的傳統(tǒng)中藥材推向國際市場，成為了中藥現(xiàn)代化開發(fā)的新課題。松花粉始載于東漢·《神農(nóng)本草經(jīng)》，為鮮黃色或淡黃色細粉，氣味甘平無毒，久服輕身益氣力，延年。國外有報道，從松樹皮中提取出的“松樹多酚”被認定為目前具抗衰老效果最強的生物活性物質(zhì)。那么松花粉蘊含松樹繁殖的全部營

4、養(yǎng)，其抗衰老效果又如何呢? 本課題已完成的實驗，證實松花粉具有促進細胞增殖、抑制自由基表達、提高端粒酶活性和降低線粒體mtDNA4977突變率等作用。從抑制衰老誘發(fā)因素的負效應(yīng)、促進細胞增殖等方面驗證了松花粉的抗衰老效果。那么，松花粉對于衰老細胞復(fù)制受限性的內(nèi)在基因調(diào)控機制又有何影響呢?衰老通路中的相關(guān)基因p161NK4A，p21CIP-1又會有怎樣的變化呢? 研究目的：分析松花粉對細胞復(fù)制性衰老中p16INK4A，p2

5、1CIP-1表達的影響。由于衰老細胞具有三項特征性的改變：細胞面積增大、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)呈藍染、細胞G1期阻滯。取該三項指標來驗證衰老細胞模型的質(zhì)量，同時探討松花粉對衰老細胞中該三項指標的影響。依據(jù)衰老發(fā)生的基因調(diào)控學說，選取癌基因p16INK4A和p21CIP-1作為衰老檢測的分子指標，檢測松花粉對其在衰老細胞中表達的影響。從衰老發(fā)生的基因調(diào)控層面，探討松花粉的抗衰老效果并分析其分子機制。 本課題主要有以

6、下研究：①建立衰老細胞模型，檢測松花粉干預(yù)對各組的單細胞面積、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)陽性率以及細胞周期的影響，從形態(tài)學、生化和DNA分布改變等外在表觀方面來確定松花粉的抗細胞復(fù)制性衰老的作用。②由于p16INK4A與p21CIP-1分別是p53-p21—pRb和p16—pRb兩條細胞衰老信號途徑中的核心成分，且表達量變幅大，易于測定。選取p161NK4A與p21CIP-1基因作為研究的靶目標，設(shè)定了兩個松花粉血清液濃度點

7、，來測定在衰老細胞中不同濃度松花粉血清液干預(yù)對其p16INK4A與p21CIP-1mRNA表達量的影響。 材料與方法： ①細胞處理：人胚肺二倍體成纖維細胞(2BS)從27代開始培養(yǎng)，隨機取8瓶30代細胞為年輕對照組。培養(yǎng)至56代建立衰老細胞模型后，取24瓶細胞隨機分成三組：衰老模型組、松花粉中劑量(120mg/dl)組、松花粉高劑量(240mg/dl)組。分別輔以普通MEM血清培養(yǎng)基、120mg/dl松花粉血清液、240

8、mg/dl松花粉血清液進行培養(yǎng)。 ②松花粉血清液配制：本課題采用花粉營養(yǎng)液的浸提技術(shù)，提取出水溶性的花粉營養(yǎng)液作為細胞實驗的干預(yù)材料，以水溶性復(fù)合體的形式研究松花粉水溶性成分的整體抗衰老藥效學機制。 ③單細胞面積、SA-β-gal染色陽性率和細胞周期的測定：采用體視學方法測定各組的平均單細胞面積，并比較松花粉處理對各平均單細胞面積的影響；免疫組化法對各組細胞進行SA-β-gal染色，測定各組的平均藍染細胞比率，即染色陽性

9、率的變化，并比較松花粉處理對其的影響；流式細胞術(shù)分析各組的細胞G0/G1、S、G2/M期比例分布狀況，計算各組的PI指數(shù)，并比較松花粉處理對細胞周期分布與PI指數(shù)的影響。 ④P16INK4A與p21CIP-1的測定：RT—PCR法測定各組細胞內(nèi)P16INK4A、p21CIP-1mRNA的表達量，比較衰老細胞組與不同濃度松花粉血清液組間p16INK4A與p21CIP-1mRNA表達的差異。 ⑤統(tǒng)計分析：采用SPSS13.0

10、分析數(shù)據(jù)。方差齊性時，行單因素方差分析，LSD方法行組間兩兩比較；方差不齊時，行多個獨立樣本非參數(shù)檢驗，Dunnett'sT3法行組間兩兩比較，P≤0.05差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： ①衰老模型組細胞出現(xiàn)單細胞面積顯著增大(P=0.023)，SA-β-gal陽性率與G1期比例顯著增高(P=0.001)，PI指數(shù)顯著下降(P<0.001)。 ②松花粉血清液處理后，衰老細胞的單細胞面積顯著減小(P<0.02)、SA-

11、β-gal染色陽性率與G1期比例均顯著下降(P<0.001)，PI指數(shù)顯著升高(P<0.05)；在松花粉高劑量與中劑量組之間，細胞周期差異有顯著性(P=0.003)。 ③衰老模型組細胞中p16INK4A與p21CIP-1的mRNA表達量均顯著上調(diào)(P<0.001，P=0.044)，松花粉血清液處理后，p16INK4AmRNA表達量出現(xiàn)顯著的下調(diào)(P<0.001)，在高劑量(240mg/dl)組與中劑量(120mg/dl)組處理組

12、之間，差異有顯著性(P=0.006)。松花粉血清液處理后，p21CIP-1mRNA的表達量無明顯改變(P=0.061)。 結(jié)論： ①自然衰老2BS細胞模型建立成功，出現(xiàn)典型的衰老形態(tài)特征，單細胞表面積、SA-β-gal染色陽性率、細胞周期等表觀指標和p16INK4A、p21CIP-1mRNA表達量出現(xiàn)典型的衰老相關(guān)的改變。 ②明確了松花粉的抗衰老效果，表現(xiàn)為衰老細胞的形態(tài)改變和單細胞表面積、SA-β-gal染色陽

13、性率、細胞周期等表觀指標的改變均有顯著改善。 ③設(shè)立了兩個不同的松花粉血清液處理濃度，在高劑量(240mg/dl)和中劑量(120mg/dl)松花粉血清液濃度間，細胞G1期比例，PI指數(shù)，p16INK4AmRNA表達量的差異有顯著性，提示松花粉抗衰老效果有劑量依賴性。 ④探討松花粉抗衰老的分子機制，在衰老模型細胞中p16INK4A，p21CIP-1的表達量均出現(xiàn)顯著上升，但是經(jīng)松花粉處理后，p16INK4AmRNA表達量