松花粉對(duì)衰老人胚肺成纖維細(xì)胞p16及p21基因表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：老齡化社會(huì)的到來(lái)使老年相關(guān)性疾病越來(lái)越受到關(guān)注。有觀點(diǎn)認(rèn)為預(yù)防老年相關(guān)性疾病的一個(gè)重要方法即延緩機(jī)體“衰老”的發(fā)生。因此，延緩機(jī)體衰老有利于改善老年人的健康素質(zhì)，有利于降低老年性疾病的發(fā)病率和惡性程度，有利于減少社會(huì)老年性疾病的治療成本。 自Hayflick等提出了細(xì)胞復(fù)制性衰老的假說(shuō)以來(lái)。大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，衰老細(xì)胞的復(fù)制受限是一種受體內(nèi)衰老相關(guān)的多組基因調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制，它們主要是一組與癌癥相關(guān)的組抑癌基因，包括p5

2、3，pRB，p16INK4A和p21CIP-1等。 早期的研究證明衰老的誘發(fā)因素可分為端粒與非端粒性誘發(fā)因素。目前觀點(diǎn)認(rèn)為端粒縮短誘發(fā)衰老與激活了衰老相關(guān)p53-p21通路有關(guān)，誘發(fā)衰老的非端粒性因素：包括自由基、線粒體DNA損傷、放射線損傷等均與細(xì)胞結(jié)構(gòu)性損傷在胞內(nèi)蓄積有關(guān)，其誘發(fā)衰老具有一條共同的下游通路，即p16—pRb通路。 衰老理論的創(chuàng)新為抗衰老藥物的篩選和藥效研究提供了有力的依據(jù)。目前抗衰老藥物的篩選研究也主

3、要通過(guò)抑制細(xì)胞的衰老表觀改變，改善衰老誘發(fā)因素的負(fù)效應(yīng)和調(diào)控衰老相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)驗(yàn)證其衰老效果。 大批中藥材在古代醫(yī)典中記載著具有延年、益壽之效，如何將具有延緩衰老作用的傳統(tǒng)中藥材推向國(guó)際市場(chǎng)，成為了中藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)的新課題。松花粉始載于東漢·《神農(nóng)本草經(jīng)》，為鮮黃色或淡黃色細(xì)粉，氣味甘平無(wú)毒，久服輕身益氣力，延年。國(guó)外有報(bào)道，從松樹(shù)皮中提取出的“松樹(shù)多酚”被認(rèn)定為目前具抗衰老效果最強(qiáng)的生物活性物質(zhì)。那么松花粉蘊(yùn)含松樹(shù)繁殖的全部營(yíng)

4、養(yǎng)，其抗衰老效果又如何呢? 本課題已完成的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)松花粉具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制自由基表達(dá)、提高端粒酶活性和降低線粒體mtDNA4977突變率等作用。從抑制衰老誘發(fā)因素的負(fù)效應(yīng)、促進(jìn)細(xì)胞增殖等方面驗(yàn)證了松花粉的抗衰老效果。那么，松花粉對(duì)于衰老細(xì)胞復(fù)制受限性的內(nèi)在基因調(diào)控機(jī)制又有何影響呢?衰老通路中的相關(guān)基因p161NK4A，p21CIP-1又會(huì)有怎樣的變化呢? 研究目的：分析松花粉對(duì)細(xì)胞復(fù)制性衰老中p16INK4A，p2

5、1CIP-1表達(dá)的影響。由于衰老細(xì)胞具有三項(xiàng)特征性的改變：細(xì)胞面積增大、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)呈藍(lán)染、細(xì)胞G1期阻滯。取該三項(xiàng)指標(biāo)來(lái)驗(yàn)證衰老細(xì)胞模型的質(zhì)量，同時(shí)探討松花粉對(duì)衰老細(xì)胞中該三項(xiàng)指標(biāo)的影響。依據(jù)衰老發(fā)生的基因調(diào)控學(xué)說(shuō)，選取癌基因p16INK4A和p21CIP-1作為衰老檢測(cè)的分子指標(biāo)，檢測(cè)松花粉對(duì)其在衰老細(xì)胞中表達(dá)的影響。從衰老發(fā)生的基因調(diào)控層面，探討松花粉的抗衰老效果并分析其分子機(jī)制。 本課題主要有以

6、下研究：①建立衰老細(xì)胞模型，檢測(cè)松花粉干預(yù)對(duì)各組的單細(xì)胞面積、β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal)陽(yáng)性率以及細(xì)胞周期的影響，從形態(tài)學(xué)、生化和DNA分布改變等外在表觀方面來(lái)確定松花粉的抗細(xì)胞復(fù)制性衰老的作用。②由于p16INK4A與p21CIP-1分別是p53-p21—pRb和p16—pRb兩條細(xì)胞衰老信號(hào)途徑中的核心成分，且表達(dá)量變幅大，易于測(cè)定。選取p161NK4A與p21CIP-1基因作為研究的靶目標(biāo)，設(shè)定了兩個(gè)松花粉血清液濃度點(diǎn)

7、，來(lái)測(cè)定在衰老細(xì)胞中不同濃度松花粉血清液干預(yù)對(duì)其p16INK4A與p21CIP-1mRNA表達(dá)量的影響。 材料與方法： ①細(xì)胞處理：人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞(2BS)從27代開(kāi)始培養(yǎng)，隨機(jī)取8瓶30代細(xì)胞為年輕對(duì)照組。培養(yǎng)至56代建立衰老細(xì)胞模型后，取24瓶細(xì)胞隨機(jī)分成三組：衰老模型組、松花粉中劑量(120mg/dl)組、松花粉高劑量(240mg/dl)組。分別輔以普通MEM血清培養(yǎng)基、120mg/dl松花粉血清液、240

8、mg/dl松花粉血清液進(jìn)行培養(yǎng)。 ②松花粉血清液配制：本課題采用花粉營(yíng)養(yǎng)液的浸提技術(shù)，提取出水溶性的花粉營(yíng)養(yǎng)液作為細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的干預(yù)材料，以水溶性復(fù)合體的形式研究松花粉水溶性成分的整體抗衰老藥效學(xué)機(jī)制。 ③單細(xì)胞面積、SA-β-gal染色陽(yáng)性率和細(xì)胞周期的測(cè)定：采用體視學(xué)方法測(cè)定各組的平均單細(xì)胞面積，并比較松花粉處理對(duì)各平均單細(xì)胞面積的影響；免疫組化法對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行SA-β-gal染色，測(cè)定各組的平均藍(lán)染細(xì)胞比率，即染色陽(yáng)性

9、率的變化，并比較松花粉處理對(duì)其的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析各組的細(xì)胞G0/G1、S、G2/M期比例分布狀況，計(jì)算各組的PI指數(shù)，并比較松花粉處理對(duì)細(xì)胞周期分布與PI指數(shù)的影響。 ④P16INK4A與p21CIP-1的測(cè)定：RT—PCR法測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)P16INK4A、p21CIP-1mRNA的表達(dá)量，比較衰老細(xì)胞組與不同濃度松花粉血清液組間p16INK4A與p21CIP-1mRNA表達(dá)的差異。 ⑤統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS13.0

10、分析數(shù)據(jù)。方差齊性時(shí)，行單因素方差分析，LSD方法行組間兩兩比較；方差不齊時(shí)，行多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，Dunnett'sT3法行組間兩兩比較，P≤0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： ①衰老模型組細(xì)胞出現(xiàn)單細(xì)胞面積顯著增大(P=0.023)，SA-β-gal陽(yáng)性率與G1期比例顯著增高(P=0.001)，PI指數(shù)顯著下降(P<0.001)。 ②松花粉血清液處理后，衰老細(xì)胞的單細(xì)胞面積顯著減小(P<0.02)、SA-

11、β-gal染色陽(yáng)性率與G1期比例均顯著下降(P<0.001)，PI指數(shù)顯著升高(P<0.05)；在松花粉高劑量與中劑量組之間，細(xì)胞周期差異有顯著性(P=0.003)。 ③衰老模型組細(xì)胞中p16INK4A與p21CIP-1的mRNA表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.001，P=0.044)，松花粉血清液處理后，p16INK4AmRNA表達(dá)量出現(xiàn)顯著的下調(diào)(P<0.001)，在高劑量(240mg/dl)組與中劑量(120mg/dl)組處理組

12、之間，差異有顯著性(P=0.006)。松花粉血清液處理后，p21CIP-1mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯改變(P=0.061)。 結(jié)論： ①自然衰老2BS細(xì)胞模型建立成功，出現(xiàn)典型的衰老形態(tài)特征，單細(xì)胞表面積、SA-β-gal染色陽(yáng)性率、細(xì)胞周期等表觀指標(biāo)和p16INK4A、p21CIP-1mRNA表達(dá)量出現(xiàn)典型的衰老相關(guān)的改變。 ②明確了松花粉的抗衰老效果，表現(xiàn)為衰老細(xì)胞的形態(tài)改變和單細(xì)胞表面積、SA-β-gal染色陽(yáng)

13、性率、細(xì)胞周期等表觀指標(biāo)的改變均有顯著改善。 ③設(shè)立了兩個(gè)不同的松花粉血清液處理濃度，在高劑量(240mg/dl)和中劑量(120mg/dl)松花粉血清液濃度間，細(xì)胞G1期比例，PI指數(shù)，p16INK4AmRNA表達(dá)量的差異有顯著性，提示松花粉抗衰老效果有劑量依賴性。 ④探討松花粉抗衰老的分子機(jī)制，在衰老模型細(xì)胞中p16INK4A，p21CIP-1的表達(dá)量均出現(xiàn)顯著上升，但是經(jīng)松花粉處理后，p16INK4AmRNA表達(dá)量