人毛乳頭細(xì)胞HSPC016基因的克隆、表達(dá)和鑒定.pdf

1、毛囊是重要的皮膚附屬器官，是毛發(fā)的主體。毛發(fā)具有調(diào)節(jié)體溫、排泄代謝物、緩沖外界機(jī)械壓力等重要生理功能，對人類而言同時(shí)還有美學(xué)、裝扮、特征辨認(rèn)等社會學(xué)意義。因毛囊異常生長所致的多毛或少毛不僅會影響毛發(fā)生理功能的正常發(fā)揮而且正在或可能將要給越來越多的患者造成心理壓力，直接影響患者的健康和生活質(zhì)量。因此，了解毛囊生長的確切機(jī)制、調(diào)控原理及探討臨床診治毛囊疾病的方法與措施已成必然。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為毛乳頭在毛囊的形態(tài)學(xué)發(fā)生和成年毛囊的周期性生長與調(diào)控

2、中起主導(dǎo)作用，毛乳頭細(xì)胞是毛囊研究的中心環(huán)節(jié)之一。造血干細(xì)胞(hematopoieticstem/progenitorcell，HSPC)相關(guān)基因HSPC016是我國復(fù)旦大學(xué)學(xué)者在人造血干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新基因，而我們首次發(fā)現(xiàn)了HSPC016基因作為上調(diào)表達(dá)基因在凝集性生長狀態(tài)人毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)cDNA文庫中的表達(dá)。對于一個(gè)新基因而言，獲取其重組蛋白，是進(jìn)一步對基因功能進(jìn)行深入研究所必需的。 毛囊的明顯特性是自我更新和周期性生長。

3、完整的毛囊生長周期包括生長期(anagen)、退行期(catagen)、休止期(telogen)。毛囊的胚胎發(fā)育和周期性生長主要依靠來源于毛囊上皮與間質(zhì)毛乳頭(dermalpapillae，DP)的相互作用。毛乳頭是真皮成分突入毛球內(nèi)形成的特殊結(jié)構(gòu)，為含血管和神經(jīng)的間充質(zhì)成分。毛乳頭細(xì)胞(dermalpapillacells，DPC)是組成毛乳頭的唯一細(xì)胞，在毛囊的胚胎發(fā)生和周期性生長過程中起著十分重要的作用，一方面提供毛囊生長和分化必

4、需的信號因子和營養(yǎng)支持，另一方面還決定毛囊的分化方向。因此，毛乳頭細(xì)胞是毛囊研究的中心環(huán)節(jié)之一。 毛乳頭是一個(gè)可誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)，它能發(fā)送或接受信號，從而影響毛囊的發(fā)育和周期性生長。通過對小鼠/大鼠模型的研究，一些與毛囊生長周期有關(guān)的調(diào)節(jié)分子如成纖維細(xì)胞生長因子(fibobalastgrowthfactors，F(xiàn)GFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bonemorphogeneticproteins，BMPs)、刺猬蛋白(sonichedgeho

5、g，Shh)、神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophins)、血小板衍生生長因子(plateletderivedgrowthfactor,PDGF)等已相繼被鑒定出來。組成毛囊的細(xì)胞如DPC、外根鞘細(xì)胞(outrootsheath，ORS)、毛母質(zhì)細(xì)胞等可分泌這些生長因子及其受體；而且就單一細(xì)胞因子而言，其產(chǎn)生和分泌都與毛囊周期的特定時(shí)相有關(guān)。但是，關(guān)于這些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)毛囊胚胎發(fā)生和毛囊生長周期的具體分子機(jī)制如通過什么信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、與什么分

6、子作用等均不十分清楚。Inamatsu等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)凝集生長狀態(tài)的DPC仍能保持誘導(dǎo)毛囊發(fā)生的能力。為了探索哪些基因在DPC凝集生長狀態(tài)下表達(dá)，篩選與DPC凝集生長相關(guān)的基因，宋志強(qiáng)博士、郝飛教授等應(yīng)用抑制性消減雜交技術(shù)成功地建立了凝集性生長的人毛乳頭細(xì)胞差異表達(dá)基因cDNA文庫，并從凝集生長狀態(tài)的人毛乳頭細(xì)胞篩選出一批上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)基因。HSPC016即是通過上述方法篩選出的與DPC凝集生長相關(guān)的基因，它被首次從CD34+造血干細(xì)

7、胞/祖細(xì)胞(CD34+hematopoieticstem/progenitorcells，HSPC)中分離鑒定，但功能不清。鑒于DPC具有干細(xì)胞的特點(diǎn)，如自我更新、凝集性生長、處于受保護(hù)的隱蔽位置、血供豐富等，有學(xué)者將DPC轉(zhuǎn)化為紅系及髓系血細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)在動物體內(nèi)可維持達(dá)1年之久，我們推測HSPC016對維持DPC凝集性生長及其功能可能發(fā)揮重要作用?；谏鲜鰲l件和原因，本實(shí)驗(yàn)對HSPC016基因的ORF序列進(jìn)行克隆并分別在大腸桿菌和畢赤

8、酵母中誘導(dǎo)表達(dá)，通過獲取其重組蛋白，為下一步對該基因功能進(jìn)行深入研究打下基礎(chǔ)。 本課題研究結(jié)果顯示，用PCR技術(shù)成功地克隆出人毛乳頭細(xì)胞HSPC016基因的功能序列，由195bp組成并與GenBank公布序列完全一致。所構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-28a(+)/HSPC016轉(zhuǎn)化工程菌E.coliBL21并經(jīng)誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳鑒定：目的蛋白Mr約為7.2kDa，與理論預(yù)測值相吻合；UVP掃描表明目的蛋白表達(dá)率約20％；N

9、-端氨基酸測序結(jié)果與預(yù)期序列完全一致。將初步純化的蛋白免疫家兔獲得兔抗HSPC016血清，ELISA檢測顯示血清滴度為320,000EU。真核表達(dá)載體pPIC9K/HSPC016轉(zhuǎn)化GS115用G418-YPD平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳鑒定：目的蛋白相對分子量(Mr)約為7.2kDa，與理論預(yù)測值相吻合；UVP掃描表明目的蛋白表達(dá)率約11.7％；Westernblot檢測具有良好的免疫反應(yīng)性；N-端氨基酸