小鼠TGF-β1shRNA真核表達載體的構建及其對胚胎發(fā)育早期平滑肌細胞分化的影響.pdf

1、研究背景及目的：
　　血管發(fā)育在胚胎期器官發(fā)育、成熟以及成體后組織損傷修復中均起重要的作用。血管平滑肌增生是許多心血管疾病諸如高血壓、動脈粥樣硬化、血管成形術后再狹窄等發(fā)病的始動環(huán)節(jié)。成體血管中血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell,VSMC）是特異性較高的細胞，其主要功能是收縮，參與調(diào)節(jié)血壓和維持組織器官的血流灌注。成體VSMC處于增殖和合成能力較低的分化表型；然而在某些病理條件如動脈粥樣硬化和血

2、管成形術后，VSMC呈現(xiàn)高合成、高增殖的合成表型。VSMC由分化表型轉變?yōu)楹铣杀硇褪悄承┬难芗膊“l(fā)生的重要病理基礎，因此對VSMC分化的調(diào)控機制研究是臨床上防治增生性心血管病的前提。
　　研究細胞分化常用的模型是胚胎干細胞(embryonic stem cells,ES細胞)。ES細胞分離于早期胚胎的內(nèi)細胞團(inner cell mass,ICM),具有自我更新和多向分化潛能兩大顯著特性，是研究早期胚胎發(fā)生、細胞組織分化、基因

3、表達調(diào)控等發(fā)育學事件的一個理想模型。胚胎小體（embryonic bodies,EB）是ES細胞在去白血病抑制因子（leukaemia inhibitory factor,LIF）培養(yǎng)下自發(fā)形成的細胞團，它可以模擬體內(nèi)早期胚胎發(fā)育的全過程，是研究VSMC譜系分化成熟的理想體外模型。RNA干擾技術是近年來發(fā)展起來的基因功能研究工具。本實驗旨在利用RNA干擾技術建立轉化生長因子β1(transforming growth factorβ1,

4、TGF-β1)shRNA真核表達載體，研究TGF-β1在胚胎發(fā)育早期對VSMC分化的影響。
　　TGF-β1是一種多功能的細胞因子，參與調(diào)節(jié)早期胚胎發(fā)育，尤其對心血管系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用；然而其調(diào)控VSMC分化、遷移、增殖等過程的機理目前并不十分明確。本實驗成功構建了TGF-β1shRNA真核表達載體并轉染ES細胞，通過建立EB二維分化模型觀察了SMα-actin陽性細胞的分化特點，初步探討了TGF-β1對胚胎早期VSM

5、C分化的影響。
　　方法：
　　1.小鼠TGF-β1shRNA真核表達載體的構建根據(jù)GenBank小鼠TGF-β1mRNA序列，設計合成三對短鏈寡核苷酸，退火后形成雙鏈DNA并克隆至入門載體pEN_mH1c。將插入目的基因片段的入門載體與帶有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)標簽的shRNA真核表達載體pDS_hpEy進行LR重組反應，完成三個TGF-β1shRNA表達載體的構建，分

6、別命名為pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc。并同時構建陰性對照載體命名為pDS_T0。
　　2.NIH/3T3細胞的培養(yǎng)和質粒的轉染用0.25％胰酶及0.53mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）室溫下消化融合的NIH/3T3細胞，傳代至3.5cm細胞培養(yǎng)皿，待細胞生長至50％～70％融合時，按Lipofectamine2000說明書用脂質體將pDS_T0、pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc真核表達載體轉染至NIH/3T

7、3細胞，并在含有G418的選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)和篩選，10d后得到穩(wěn)定表達上述載體的細胞克隆。
　　3.克隆的擴增和鑒定穩(wěn)定轉染pDS_T0、pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc真核表達載體的NIH/3T3細胞克隆擴增后分別提取總RNA和總蛋白，用RT-PCR和WesternBlot檢測TGF-β1的表達差異，鑒定表達載體沉默效率。同時利用BrdU摻入和流式細胞術觀察TGF-β1表達下調(diào)后對NIH/3T3細胞增殖功能的影響，從功

8、能上鑒定上述載體的沉默效率。
　　4.小鼠ESCs的培養(yǎng)小鼠ESCs培養(yǎng)于經(jīng)絲裂霉素C（mitomycinC,MMC）10μg/mL處理2h的飼養(yǎng)層細胞STO（小鼠胚胎成纖維細胞株）上。當ESCs生長至亞融合時進行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。
　　5.TGF-β1shRNAESCs株的建立將小鼠ESCs接種于0.1％明膠包被的六孔板中，待細胞生長至約50％～70％融合時，按Lipofectamine2000說明書用脂質

9、體將TGF-β1shRNA載體pDS_Tc和陰性對照載體pDS_T0轉染至ESCs，18h后細胞傳代至100mm細胞培養(yǎng)皿中，以500mg/LG418進行篩選，1w后在熒光顯微鏡下挑取GFP陽性單克隆并傳代。
　　6.EBs二維模型的建立ESCs培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25％胰酶及0.53mmol/L乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）消化后，接種到明膠包被的培養(yǎng)皿中實施選擇性

10、篩選，3h后大部分STO細胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液除無白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）外與ESCs培養(yǎng)液相同。懸浮培養(yǎng)5d后，將EBs接種于0.1％明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，制備二維模型；
　　7.免疫細胞化學染色固定的EBs經(jīng)0.05mol/LTBS洗滌后，在含0.25％TritonX-100和0.5mol/LNH4Cl的TBS中通透20min。

11、5％山羊血清室溫封閉1h后，與一抗在4°C孵育過夜。一抗為SMα-actin。不加一抗做陰性對照片。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC）或異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）標記抗體。
　　8.RT-PCR參照Trizol說明書，提取不同時間點EBs中的RNA。取RNA1μg進行SMα-actin、myocar

12、din及GAPDH的半定量PCR。
　　9.蛋白質印跡分析參照常規(guī)方法，提取不同時間點ESCs及EBs中的總蛋白，然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜、抗體結合及顯色。一抗分別為SMα-actin、myocardin和β-actin抗體。用增強型化學發(fā)光試劑盒檢測目的蛋白。
　　結果：
　　1.穩(wěn)定表達TGF-β1shRNA的NIH/3T3細胞篩選以濃度為500mg/L的G418篩選穩(wěn)定表達TGF-β1shRNA的

13、NIH/3T3細胞。在熒光顯微鏡下可觀察到轉染的細胞表達GFP。
　　2.TGF-β1shRNA表達載體對NIH/3T3細胞TGF-β1表達的影響RT-PCR和蛋白質印跡分析結果顯示，轉染pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc真核表達載體的細胞其TGF-β1mRNA和蛋白表達水平較對照組pDS_T0呈現(xiàn)不同程度下調(diào)，以pDS_Tc組最明顯。
　　3.TGF-β1表達下調(diào)對NIH/3T3細胞增殖功能的影響以BrdU摻入實驗檢

14、測干擾載體對細胞增殖能力的抑制作用，結果顯示，轉染pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc的細胞BrdU染色陽性率均較pDS_T0組明顯減少，以pDS_Tc組減少最為顯著，提示后者具有較強基因沉默效率。同時采用流式細胞術（flow cytometry,FCM）分析細胞周期，結果顯示轉染pDS_Ta、pDS_Tb和pDS_Tc的細胞均較對照組pDS_T0出現(xiàn)明顯G1期阻滯，其中以pDS_Tc組G1期阻滯最為明顯。
　　4.穩(wěn)定表達T

15、GF-β1shRNA的ESCs篩選及鑒定于熒光顯微鏡下挑取表達GFP的pDS_Tc和pDS_T0陽性ESCs克隆并傳代擴增。以WesternBlot檢測上述兩種ESCs克隆及其在分化成EBs后TGF-β1的表達變化，結果顯示pDS_Tc陽性ESCs克隆及EBs的TGF-β1蛋白表達較pDS_T0對照組明顯降低。
　　5.EBs各發(fā)育階段的形態(tài)結構EBs經(jīng)懸浮培養(yǎng)后迅速分化，1d～2d后可形成典型的簡單EBs（simple embr

16、yoid bodies,SEBs），隨培養(yǎng)時間延長，SEBs進一步分化形成成熟囊性EBs（cystic embryoid bodies,CEBs），CEBs具有類似早期胚胎的原始內(nèi)胚層、基底膜、柱狀原始外胚層及囊腔等結構。
　　6.TGF-β1表達下調(diào)對EBs二維分化模型形態(tài)學的影響懸浮培養(yǎng)5d的EBs接種于明膠包被的24孔板中，EBs貼壁后第2d對SMα-actin免疫熒光染色陽性細胞即平滑肌樣細胞分布特點進行觀察，結果顯示轉染

17、pDS_T0載體的對照組EBs貼壁分化后，90％以上SMα-actin免疫熒光染色陽性細胞隨著分化時間的延長散在分布于EBs延伸細胞的周邊。轉染pDS_Tc載體的EBs分化早期SMα-actin免疫熒光染色陽性的細胞成群出現(xiàn)在EBs邊緣細胞密集處，且分化細胞向周邊延伸速度較慢。
　　7.TGF-β1表達下調(diào)對EBs分化不同時期VSMC分化標志物表達的影響對兩組EBs實施RT-PCR和WesternBlot檢測SMα-actin和m

18、yocardin兩組分化標志物在表達初期和表達高峰期的差異，結果顯示轉染pDS_Tc載體的EBs在發(fā)育過程中SMα-actin和myocardin的表達均低于轉染pDS_T0載體的陰性對照組，提示TGF-β1可明顯影響VSMC的分化。
　　結論：
　　1.帶有GFP標簽的TGF-β1shRNA真核表達載體能夠阻斷ESCs及EBsTGF-β1基因表達，可作為研究TGF-β1調(diào)控血管發(fā)育機制的一個工具；
　　2.TGF-β

19、1表達下調(diào)可抑制EBs二維分化模型中平滑肌樣細胞的分化，且SMα-actin染色陽性細胞主要密集分布在EBs周圍分化細胞群邊緣，細胞向周邊延伸速度減慢；
　　3.ESCs及其形成的EBsTGF-β1表達降低后，VSMC分化標志物表達明顯降低，提示TGF-β1可以促進胚胎發(fā)育早期VSMC的分化。
　　4.利用RNAi技術構建特定基因表達下調(diào)的ESCs及EBs模型可以作為一種理想的替代基因敲除的分子生物學工具用于基因功能學的研究