胚胎血管發(fā)育早期PDGF-BB對(duì)血管平滑肌趨化和分化的影響.pdf

1、目的：新生血管的穩(wěn)定和成熟已成為目前血管新生研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題。血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖及其向內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)形成的原始血管網(wǎng)的募集是新生血管穩(wěn)定和成熟的關(guān)鍵步驟。但對(duì)于胚胎血管發(fā)育早期影響VSMCs募集、趨化分子機(jī)制的研究非常有限，主要原因之一是胚胎發(fā)育早期VSMCs的分離純化非常困難。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem c

2、ells，ESCs)在體外可以自發(fā)地分化成擬胚體(embryoid bodies，EBs)并可以模擬胚胎血管形成的過程，為早期VSMCs譜系形成、分化及成熟等機(jī)制的研究提供了一種有價(jià)值的體外模型。本實(shí)驗(yàn)室成功構(gòu)建了平滑肌特異性蛋白SM22 α啟動(dòng)子控制下穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的ESCs，可不經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色，在活細(xì)胞狀態(tài)下直接觀察到由ESCs向VSMCs分化。本研究旨在此基礎(chǔ)上建立胚胎血管發(fā)育早期VSMCs趨化模型，采用已知VS

3、MCs體外趨化劑血小板源性生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)作為外源性趨化因子，初步觀察PDGF-BB對(duì)胚胎血管發(fā)育早期VSMCs遷移的影響。 VSMCs的發(fā)育與分化是一個(gè)極其復(fù)雜的多基因調(diào)控過程。PDGF-BB是一種強(qiáng)有絲分裂原，以往研究多認(rèn)為其能夠使來源于成熟血管的VSMCs的多種分化標(biāo)志物基因表達(dá)下調(diào)，但其是否對(duì)具有全能分化作用的ESCs向VSMCs的分化具

4、有抑制作用，迄今尚不清楚。本研究擬觀察胚胎發(fā)育早期VSMCs分化標(biāo)志物SMα-actin、SM22a、myocardin、SMMHC的表達(dá)時(shí)相，并采用已知血小板源性生長因子受體抑制劑AG1296作為阻斷劑，初步探討PDGF-BB對(duì)胚胎血管發(fā)育早期VSMCs分化及其標(biāo)志物表達(dá)時(shí)相的影響。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng)小鼠ESCs培養(yǎng)于經(jīng)絲裂霉素C10μg/mL處理2 h的飼養(yǎng)層細(xì)胞STO(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株)上。當(dāng)ESCs生長至

5、亞融合時(shí)進(jìn)行傳代，每天換液以維持其未分化狀態(tài)。 2．ESCs分化及EBs模型的建立 ESCs細(xì)胞培養(yǎng)至亞融合狀態(tài)，用0.25﹪胰酶及0.53 mmol/L乙二胺四乙酸消化后，接種到明膠包被的培養(yǎng)皿中實(shí)施選擇性篩選，3 h后大部分STO細(xì)胞已貼壁。將未貼壁的ESCs稀釋后接種于細(xì)菌培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液除無白血病抑制因子外與ESCs培養(yǎng)液相同。懸浮培養(yǎng)后5d或6d，將EBs接種于0.1﹪明膠鋪被的培養(yǎng)皿中貼壁培養(yǎng)，每天換液。 3

6、．Under-agale08e模型制備用DMEM配制含1﹪瓊脂糖和1﹪牛血清白蛋白混合配制的凝膠，取3ml鋪于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，室溫下冷卻至凝固。用空心金屬吸管模具制作3個(gè)直徑5mm、間距2mm的小孔。在倒置顯微鏡下小心吸取懸浮培養(yǎng)6d的1個(gè)EBs加到中間小孔中貼壁培養(yǎng)，每天換液。 4．慢速顯微攝像技術(shù)(time-lapse) Under-agarose模型中EBs貼壁第6+20d時(shí)，置5﹪CO<,2>，37℃恒溫小室，在配有

7、自動(dòng)攝像裝置(CoolSNAPfx)的倒置相差顯微鏡(Olympus IX-70)下觀察細(xì)胞移行，每隔10 min作序列攝影，連續(xù)拍攝12h。遷移速率采用圖像分析軟件(Image-Pro Plus5.1)示蹤程序?qū)嵤┓治鰷y定。 5．免疫細(xì)胞化學(xué)染色固定的EBs經(jīng)0.05 mol/L TBS中洗滌后，在含0.25﹪ Triton X-100和0.5 mol/L NH4Cl的TBS中通透20min。5﹪牛血清白蛋白室溫封閉1h后，與

8、一抗在4℃孵育過夜。一抗包括Sma-actin、Laminin、myocardin、SMMHC、PECAM-1(CD31)。不加一抗做陰性對(duì)照片。二抗為四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)或異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗體。 6．RT-PCR 參照Trizol說明書，提取不同時(shí)間點(diǎn)Ebs中的RNA。取RNA 1μg進(jìn)行下述指標(biāo)半定量PCR：PECAM-1、SM22a、myocardin、SMMHC及GAPDH。 7．蛋白

9、質(zhì)印跡分析參照常規(guī)方法，提取不同時(shí)間點(diǎn)Ebs中的總蛋白，然后行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合及顯色。一抗分別為SMα-actin、myocardin、SMMHC和β-actin抗體。用ECL試劑盒檢測1．ESCs形態(tài)特征 ESCs在STO飼養(yǎng)層上呈未分化狀態(tài)，形成致密的細(xì)胞集落，集落邊緣光滑，內(nèi)部無清晰細(xì)胞邊界。 2．Ebs各發(fā)育階段的形態(tài)結(jié)構(gòu) Ebs經(jīng)懸浮培養(yǎng)后迅速分化，1 d～2d后可形成典型的簡單Ebs(sim

10、ple embryoid bodies，SEBs)，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，SEBs進(jìn)一步分化形成成熟囊性Ebs(cystic embryoid bodies，CEBs)，CEBs具有類似早期胚胎的原始內(nèi)胚層、基底膜、柱狀原始外胚層及囊腔等結(jié)構(gòu)。 3．Under-agarose模型中Ebs分化特征在under-agarose凝膠中，擬胚體在無外源性生長因子存在的條件下可自發(fā)向心肌細(xì)胞、Ecs和VSMCs分化，說明under-agaros

11、e凝膠中的Ebs．具有較完全的分化能力。 4．VSMCs及Ecs特異性標(biāo)志物的表達(dá)時(shí)相胚胎血管發(fā)育早期SMα-actin、myocardin、SM22a、SMMHC分別在Ebs第0(ESCs)、8、11、13 d丌始有表達(dá)，表達(dá)高峰分別在第10、20、25、25 d左右。CD31在未分化的ESCs即有表達(dá)隨后呈先下調(diào)再上調(diào)的變化特點(diǎn)．于Ebs第14 d形成條索狀或管腔樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)高峰在第8 d左右。 5．外源性PDGF-

12、BB對(duì)VSMCs趨化的影響擬胚體貼壁分化20 d時(shí)，對(duì)照組及4種濃度PDGF-BB(5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml)組VSMCs的平均遷移速率分別為(94.07±23.80)μm/h、(118.08±31.63)μm/h、(173.53±24.58)μm/h、(380.74±39.56)μm/h和(335.62±32.16)μm/h，峰值濃度為20 ng/ml。經(jīng)濃度>10 ng/ml PDGF-B

13、B處理后，VSMCs向PDGF-BB孔方響移行，對(duì)照組、低濃度PDGF-BB組VSMCs呈不規(guī)則性遷移。 6．外源性AGl296對(duì)VSMCs分化的影響 AG1296三種濃度(0μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L)處理后SMα-actin、myocardin、SM22α、SMMHC蛋白表達(dá)及myocardin、SM22α、SMMHC mRNA表達(dá)均無明顯差異。 結(jié)論 1．Under-agarose

14、模型能夠模擬胚胎血管發(fā)育早期全過程，可用于研究不同生長因子對(duì)VSMCs趨化的影響。外源性PDGF-BB能定向誘導(dǎo)胚胎血管發(fā)育早期VSMCs遷移，其定向趨化作用在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系。 2．Ebs發(fā)育過程中存在著自發(fā)的VSMCs分化，SMα-actin表達(dá)最早，依次為myocardin、SM22α、SMMHC；Ebs中VSMCs的表達(dá)比Ecs表達(dá)相對(duì)延遲：PDGF-BB對(duì)Ebs分化早期VSMCs標(biāo)志物表達(dá)的調(diào)控可能不是必要的。