大鼠shRNA-Slfn1重組腺病毒載體的構建及其對血管平滑肌細胞增殖的影響.pdf

1、目的：構建帶有增強型熒光蛋白（EGFP）標記的針對大鼠Slfn1（Schlafen1，睡眠因子1）的shRNA（發(fā)夾狀RNA）干擾載體，并進行腺病毒包裝，將其轉染至原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）48h后，觀察Slfn1的沉默表達對VSMCs增殖的影響。
　　方法：1、根據Rat Slfn1基因的轉錄本設計并合成3個干擾RNA靶點shRNA-Slfn1（1）、shRNA-Slfn1（2）、shRNA-Slfn1（3）和1

2、個陰性對照序列NC-shRNA，并將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列，連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體（pDKD-CMV-U6-shRNA）的U6啟動子下游，替換掉原來的ccdB基因；經菌落PCR篩選轉化子，其陽性克隆進行測序驗證，將正確的克隆進行高純度質粒抽提；利用Admax系統(tǒng)，將3種目的穿梭質粒、1種陰性對照穿梭質粒分別與腺病毒骨架質粒共轉染到HEK293細胞中重組獲得病毒后進行小量擴增及病毒滴度測定；利用Slfn1過表達腺病

3、毒質粒中目的基因攜帶Flag標簽，通過Western Blot檢測Slfn1過表達腺病毒質粒與靶點質粒共轉染293T細胞中Flag的表達，觀察靶點質粒對Slfn1表達的影響。2、通過組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs，應用倒置相差顯微鏡對不同培養(yǎng)時間的細胞進行形態(tài)學觀察，使用免疫熒光法對培養(yǎng)細胞進行鑒定。3、使用最適感染復數(shù)的shRNA-Slfn1（1）重組腺病毒轉染VSMCs48h后，應用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達情況，并使用流式細

4、胞儀檢測其轉染效率，通過PCR檢測Slfn1 mRNA的表達，最后使用CCK-8檢測Slfn1的沉默表達對VSMCs增殖的影響。
　　結果：1、經菌落PCR鑒定獲得陽性克隆并進行測序驗證正確，表明構建質粒成功；經腺病毒包裝及病毒擴增與純化后，shRNA-Slfn1（1）、shRNA-Slfn1（2）、shRNA-Slfn1（3）及NC-shRNA的病毒滴度分別為1.0x1011 ifu/ml，2.5x1011 ifu/ml，6.3

5、x1010 ifu/ml，5.5x1010 ifu/ml。Western Blot證實shRNA-Slfn1（1）和 shRNA-Slfn1（3）能顯著降低293T細胞中Flag的表達，確定shRNA-Slfn1（1）及shRNA-Slfn1（3）為目的質粒。2、原代培養(yǎng)第4-6天時，部分組織塊周圍開始有長梭形細胞爬出；第7-9天時，組織塊周圍細胞爬出較少的呈網狀生長，細胞爬出較多的呈漩渦狀生長，致密排列呈束狀；第10-14天時，細胞呈

6、放射狀、典型的“峰—谷”樣結構，相互融合達80%左右即可傳代，此時傳代細胞相比原代細胞生長速度明顯加快，細胞變大，折光性減弱。免疫熒光染色鑒定可見VSMCs特異性的α-平滑肌肌動蛋白（α-SM-actin）表達，表達的陽性細胞數(shù)在95%以上。3、shRNA-Slfn1（1）重組腺病毒轉染VSMCs48h后，倒置熒光顯微鏡下的EGFP、流式細胞儀檢測的轉染效率均達80%以上；PCR結果顯示：Slfn1干擾組與Slfn1干擾對照組相比，Sl