大鼠shRNA-Slfn1重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：構(gòu)建帶有增強(qiáng)型熒光蛋白（EGFP）標(biāo)記的針對(duì)大鼠Slfn1（Schlafen1，睡眠因子1）的shRNA（發(fā)夾狀RNA）干擾載體，并進(jìn)行腺病毒包裝，將其轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）48h后，觀察Slfn1的沉默表達(dá)對(duì)VSMCs增殖的影響。
　　方法：1、根據(jù)Rat Slfn1基因的轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)并合成3個(gè)干擾RNA靶點(diǎn)shRNA-Slfn1（1）、shRNA-Slfn1（2）、shRNA-Slfn1（3）和1

2、個(gè)陰性對(duì)照序列NC-shRNA，并將單鏈的引物退火成雙鏈oligo序列，連接入雙酶切線性化的RNA干擾載體（pDKD-CMV-U6-shRNA）的U6啟動(dòng)子下游，替換掉原來(lái)的ccdB基因；經(jīng)菌落PCR篩選轉(zhuǎn)化子，其陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將正確的克隆進(jìn)行高純度質(zhì)粒抽提；利用Admax系統(tǒng)，將3種目的穿梭質(zhì)粒、1種陰性對(duì)照穿梭質(zhì)粒分別與腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中重組獲得病毒后進(jìn)行小量擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定；利用Slfn1過表達(dá)腺病

3、毒質(zhì)粒中目的基因攜帶Flag標(biāo)簽，通過Western Blot檢測(cè)Slfn1過表達(dá)腺病毒質(zhì)粒與靶點(diǎn)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞中Flag的表達(dá)，觀察靶點(diǎn)質(zhì)粒對(duì)Slfn1表達(dá)的影響。2、通過組織塊貼壁法原代培養(yǎng)VSMCs，應(yīng)用倒置相差顯微鏡對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，使用免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。3、使用最適感染復(fù)數(shù)的shRNA-Slfn1（1）重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs48h后，應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)情況，并使用流式細(xì)

4、胞儀檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率，通過PCR檢測(cè)Slfn1 mRNA的表達(dá)，最后使用CCK-8檢測(cè)Slfn1的沉默表達(dá)對(duì)VSMCs增殖的影響。
　　結(jié)果：1、經(jīng)菌落PCR鑒定獲得陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證正確，表明構(gòu)建質(zhì)粒成功；經(jīng)腺病毒包裝及病毒擴(kuò)增與純化后，shRNA-Slfn1（1）、shRNA-Slfn1（2）、shRNA-Slfn1（3）及NC-shRNA的病毒滴度分別為1.0x1011 ifu/ml，2.5x1011 ifu/ml，6.3

5、x1010 ifu/ml，5.5x1010 ifu/ml。Western Blot證實(shí)shRNA-Slfn1（1）和 shRNA-Slfn1（3）能顯著降低293T細(xì)胞中Flag的表達(dá)，確定shRNA-Slfn1（1）及shRNA-Slfn1（3）為目的質(zhì)粒。2、原代培養(yǎng)第4-6天時(shí)，部分組織塊周圍開始有長(zhǎng)梭形細(xì)胞爬出；第7-9天時(shí)，組織塊周圍細(xì)胞爬出較少的呈網(wǎng)狀生長(zhǎng)，細(xì)胞爬出較多的呈漩渦狀生長(zhǎng)，致密排列呈束狀；第10-14天時(shí)，細(xì)胞呈

6、放射狀、典型的“峰—谷”樣結(jié)構(gòu)，相互融合達(dá)80%左右即可傳代，此時(shí)傳代細(xì)胞相比原代細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快，細(xì)胞變大，折光性減弱。免疫熒光染色鑒定可見VSMCs特異性的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SM-actin）表達(dá)，表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在95%以上。3、shRNA-Slfn1（1）重組腺病毒轉(zhuǎn)染VSMCs48h后，倒置熒光顯微鏡下的EGFP、流式細(xì)胞儀檢測(cè)的轉(zhuǎn)染效率均達(dá)80%以上；PCR結(jié)果顯示：Slfn1干擾組與Slfn1干擾對(duì)照組相比，Sl