突變型p53的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用研究.pdf

1、在50％以上的腫瘤組織中，TP53基因發(fā)生了突變。絕大多數(shù)的p53突變是發(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域上的錯(cuò)義突變。突變型p53不但失去了腫瘤抑制功能，而且還獲得了新的致癌功能，這種獲得性功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段發(fā)揮著重要的促進(jìn)作用。突變型p53可能與細(xì)胞內(nèi)的其他蛋白相互作用調(diào)節(jié)新的靶基因，但具體機(jī)制尚不清楚。本論文關(guān)于突變型p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)的研究，可以深化對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的理解，為癌癥預(yù)防和治療提供新思路和新策略。
　　我們以乳

2、腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468（該細(xì)胞中p53蛋白的第273位氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻M氨酸，即p53R273H）為研究對(duì)象，采用染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)合芯片技術(shù)(ChIP-on-chip)，全基因組范圍內(nèi)鑒定p53R273H的靶基因。通過(guò)MEME-chip程序?qū)hIP-on-chip的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到p53-R273H的潛在結(jié)合基序(binding motif)為GGCGG[CT] GGCGGCGGC[GT]GCGG[CG]。這個(gè)序列不同

3、于野生型p53結(jié)合基序，而與Sp1的結(jié)合基序重疊。我們還對(duì)p53R273H的靶基因進(jìn)行了基因組定位、基因注釋、KEGG信號(hào)通路分析、相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建等生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)除了Y和21號(hào)染色體上的靶基因較少之外，p53R273H的靶基因幾乎在其它染色體上平均分布。p53R273H的靶基因主要是細(xì)胞周期以及增殖過(guò)程相關(guān)的基因，參與Wnt、TGF-beta和MAPK等信號(hào)通路。從我們構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)連接圖來(lái)看，基因連接度較高的hub基因也主要是Wn

4、t、TGF-beta和MAPK等信號(hào)通路中的基因。
　　由于我們發(fā)現(xiàn)p53R273H的結(jié)合基序和Sp1的結(jié)合基序重疊，因此，我們推測(cè)p53R273H可能通過(guò)Sp1的介導(dǎo)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，或者與Sp1共同調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。于是，我們用內(nèi)源和外源的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Sp1和p53R273H的相互作用，發(fā)現(xiàn)p53R273H和Sp1確實(shí)有相互作用。接下來(lái)，我們構(gòu)建了Sp1的轉(zhuǎn)錄活性報(bào)告質(zhì)粒（含有4個(gè)Sp1的結(jié)合序列），并分別和野生型p53以及p5

5、3R273H突變體的表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p53R273H后熒光值顯著增加，并隨著轉(zhuǎn)染量的增加而增加，且在有Sp1存在的情況下熒光素酶活性比Sp1不存在的情況下熒光值高。而轉(zhuǎn)染野生型p53后熒光值下降。這些結(jié)果說(shuō)明野生型p53抑制轉(zhuǎn)錄因子Sp1的活性，而p53-R273H突變體顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子Sp1的活性。
　　以上結(jié)果說(shuō)明，有可能p53R273H通過(guò)與Sp1相互作用，調(diào)控Wnt、TGF-beta和MAPK等信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因