在肝癌細(xì)胞中突變型P53與GABPA相互作用上調(diào)突變型端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT表達(dá).pdf

1、肝細(xì)胞肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別排第六位和第二位。由于起病隱匿，早期沒有癥狀或癥狀不明顯，進(jìn)展迅速，確診時(shí)大多數(shù)病人已經(jīng)達(dá)到晚期，發(fā)生了局部侵襲或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難，生存期短，預(yù)后差。近些年來關(guān)于肝細(xì)胞肝癌發(fā)病機(jī)制的研究越來越多，如細(xì)胞周期調(diào)控，表觀遺傳調(diào)控，端粒維持，基因突變等都在肝細(xì)胞肝癌發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。已有研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞肝癌中存在P53蛋白的突變和TERT啟動(dòng)子突變。P5

2、3蛋白是在人類腫瘤的發(fā)生過程中起著重要作用的抑癌蛋白，P53蛋白的突變或失活與多種人類腫瘤的發(fā)生相關(guān)。P53蛋白最常見的突變是單一位點(diǎn)的錯(cuò)義突變，這種突變使正常的P53不能表達(dá)，失去了其原有的抑癌功能，表達(dá)突變型P53蛋白并獲得促癌功能，因此這種突變又被稱為功能獲得性突變。在肝細(xì)胞肝癌中P53蛋白的功能獲得性突變率高達(dá)32％。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶TERT是端粒酶的催化活性的亞單位，其在多種腫瘤中都處于異常激活的狀態(tài)，使細(xì)胞獲得無限增殖的能力，

3、因此被認(rèn)為是腫瘤的重要標(biāo)志物之一。TERT啟動(dòng)子區(qū)特異性突變則是腫瘤細(xì)胞中TERT異常激活的重要機(jī)制之一。研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞肝癌中端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT啟動(dòng)子的突變率高達(dá)55％。GABPA是GA結(jié)合蛋白亞單位a，其作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，發(fā)揮著DNA結(jié)合的功能，并且它還參與了細(xì)胞色素氧化酶的活化和線粒體功能的細(xì)胞核調(diào)控機(jī)制。已證實(shí)在膀胱癌、黑色素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中GABPA可以選擇性結(jié)合于突變的TERT啟動(dòng)子產(chǎn)生的ETS結(jié)構(gòu)域，從而激活TERT

4、表達(dá)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在肝細(xì)胞肝癌中TERT啟動(dòng)子突變率高，但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。GABPA是否也能以相同的方式激活并調(diào)控肝細(xì)胞肝癌中突變型TERT的表達(dá)，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，有待研究。肝細(xì)胞肝癌中P53蛋白的突變也很常見，那么突變的P53和GABPA，TERT之間是否存在相互調(diào)控關(guān)系，值得深入探討。
　　研究目的:
　　研究人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系中經(jīng)典的抑癌蛋白P53的功能獲得性突變是否可以通過GABPA介導(dǎo)或與GABPA

5、共同調(diào)控端粒逆轉(zhuǎn)錄酶TERT的轉(zhuǎn)錄及其作用機(jī)制，為發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞肝癌中TERT調(diào)控的新機(jī)制，進(jìn)而尋找新的分子靶標(biāo)提供理論依據(jù)。
　　研究方法:
　　(1)檢測(cè)肝癌細(xì)胞系TERT啟動(dòng)子的突變情況:分別提取四種肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7、Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5的全基因組DNA，設(shè)計(jì)TERT啟動(dòng)子引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序，篩選出TERT啟動(dòng)子突變(C228T)的細(xì)胞系。
　　(2)檢測(cè)肝癌

6、細(xì)胞系HepG2、Huh-7中P53蛋白的表達(dá)水平:分別提取HepG2、Huh-7細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)P53蛋白的表達(dá)水平，其中HepG2細(xì)胞為野生型P53蛋白，Huh-7細(xì)胞為Y220C突變型P53蛋白。
　　(3)檢測(cè)特異性siRNA下調(diào)或野生型/突變型高表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)P53表達(dá)對(duì)TERT表達(dá)的影響:分別在HepG2、Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照或P53siRNA，72h后提取細(xì)胞總蛋白，Wester

7、n Blotting檢測(cè)P53蛋白水平，同時(shí)提取細(xì)胞RNA，qRT-PCR檢測(cè)TERT mRNA水平。在HepG2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染野生型P53高表達(dá)質(zhì)粒和R175H突變的P53高表達(dá)質(zhì)粒，48h后提取細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)P53蛋白水平，并提取RNA，qRT-PCR檢測(cè)TERT mRNA水平。
　　(4)研究特異性siRNA下調(diào)GABPA表達(dá)對(duì)TERT表達(dá)的影響:分別在HepG2、Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性對(duì)

8、照或GABPA siRNA，72h后提取細(xì)胞總蛋白，Western Blotting檢測(cè)GABPA蛋白水平，同時(shí)提取細(xì)胞RNA，qRT-PCR檢測(cè)TERTmRNA水平。
　　(5)免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)P53蛋白與GABPA蛋白相互作用:提取HepG2、Huh-7細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)，檢測(cè)P53蛋白與GABPA蛋白的結(jié)合情況。
　　(6)熒光素酶活性試驗(yàn)檢測(cè)P53對(duì)TERT啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)作用:構(gòu)建TERT啟動(dòng)子區(qū)域C228T

9、位點(diǎn)突變型啟動(dòng)子報(bào)告質(zhì)粒，在Huh-7細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染P53siRNA和GABPA siRNA，以及共轉(zhuǎn)染P53siRNA和GABPA siRNA，24h后再轉(zhuǎn)染TK和突變型報(bào)告質(zhì)粒，48h后收集細(xì)胞檢測(cè)螢火蟲熒光和海腎熒光。
　　研究結(jié)果:
　　(1)四種肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7、Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5的TERT啟動(dòng)子測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果顯示HepG2、Huh-7中TERT啟動(dòng)子為C228T位點(diǎn)突變型啟動(dòng)

10、子，而Hep3B2.1.7、PLC/PRF/5中TERT啟動(dòng)子為野生型啟動(dòng)子。
　　(2)肝癌細(xì)胞系HepG2中P53蛋白為野生型，而肝癌細(xì)胞系Huh-7中為Y220C位點(diǎn)突變型P53蛋白。HepG2中野生型P53和Huh-7中Y220C位點(diǎn)突變型P53蛋白在細(xì)胞內(nèi)均有明顯表達(dá)，并且突變型P53蛋白表達(dá)水平明顯高于野生型P53蛋白。
　　(3)在肝癌細(xì)胞系HepG2中抑制P53蛋白表達(dá)后TERT mRNA水平升高，高表達(dá)野生

11、型P53后TERT mRN水平降低，而高表達(dá)突變型P53后TERT mRNA水平卻升高。在Huh-7中抑制突變型P53蛋白表達(dá)后TERTmRNA水平降低。
　　(4)肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh-7中抑制GABPA蛋白表達(dá)后TERT mRNA水平均降低。
　　(5)在肝癌細(xì)胞系HepG2中野生型P53蛋白與GABPA蛋白未見明顯結(jié)合，而在Huh-7細(xì)胞中突變型P53蛋白與GABPA蛋白存在明顯結(jié)合。
　　(6)在肝癌細(xì)

12、胞系Huh-7中抑制突變型P53表達(dá)或抑制GABPA表達(dá)后，TERT啟動(dòng)子活性均有不同程度的降低，而同時(shí)抑制突變型P53和GABPA表達(dá)后，TERT啟動(dòng)子活性降低程度更為顯著。
　　研究結(jié)論:
　　(1)在不同的肝癌細(xì)胞系P53的表型不同。HepG2中為野生型P53蛋白，Huh-7中為Y220C位點(diǎn)突變型P53蛋白，并且兩種表型在各自的細(xì)胞中均有明顯表達(dá)。
　　(2)在不同的肝癌細(xì)胞系P53的表型影響其對(duì)TERT的轉(zhuǎn)錄