芪蛭腎綜顆粒對難治腎病綜合征患者硫氧還蛋白系統(tǒng)、尿miRNA-192、29c表達(dá)的研究.pdf

1、原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)是以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫等為特征，在激素標(biāo)準(zhǔn)療法治療后，出現(xiàn)激素抵抗、依賴或者無效或頻繁復(fù)發(fā)，從而成為難治性腎病綜合征(refractory nephropathy syndrome，RNS)。目前RNS的發(fā)病機(jī)制上不完全清楚，臨床治愈率較低，缺乏有效的治療手段，因此，早期診斷、有效地治療、判斷預(yù)后成為RNS醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極為重要的問題。
　　 R

2、NS的發(fā)生發(fā)展與多重因素相關(guān)，研究證實(shí)，RNS與增強(qiáng)的氧化應(yīng)激中的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)反應(yīng)有關(guān)，ROS可能參與了腎小球足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等腎小球?yàn)V過屏障的損傷及后來蛋白尿的發(fā)生過程，且與病情的輕重密切相關(guān)，所以抗氧化治療逐漸被人們所重視。硫氧還蛋白系統(tǒng)是一類具有氧化還原活性的小分子蛋白系統(tǒng)，由硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)和硫氧還蛋白還原酶(T

3、RX-R)3部分組成，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、對抗氧化應(yīng)激、激活轉(zhuǎn)錄因子、促進(jìn)細(xì)胞生長以及抑制細(xì)胞凋亡等作用。TRX在人體多種組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)來對抗氧化應(yīng)激。硫氧還蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interactingprotein，TXNIP)是TRX的結(jié)合蛋白之一，通過抑制硫氧還蛋白系統(tǒng)的功能而發(fā)揮介導(dǎo)氧化應(yīng)激作用。因此，TRX和TXNIP在氧化應(yīng)激中均發(fā)揮著重要的作用，是機(jī)體維持氧化還原

4、平衡的重要因子。通過對RNS患者血漿TRX、TXNIP表達(dá)水平測定，來探討硫氧還蛋白系統(tǒng)在RNS患者發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 同時(shí)，microRNA(miRNA)具有多種生物學(xué)功能，在進(jìn)化上高度保守，在生長發(fā)育、生理功能上起重要作用，尤其對惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重大影響。miRNA與mRNA相比，在體外更穩(wěn)定，在體內(nèi)代謝周期更長，它們參與調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后，通過信使RNA降解或轉(zhuǎn)化抑制蛋白質(zhì)合成。許多miRNA物種在不同病理?xiàng)l件

5、對腎臟細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，可能參與腎臟疾病的發(fā)病機(jī)制。研究證實(shí)miRNA在尿液中大量并穩(wěn)定存在，因此在腎臟疾病中尿miRNA有潛在的發(fā)展前景。許多RNS的病理中存在細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的蓄積、彌漫或結(jié)節(jié)性腎小球硬化、小管萎縮、間質(zhì)纖維化等，miR-192參與ECM的發(fā)病過程，而miR-192是唯一一種被發(fā)現(xiàn)在腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)的miRNA。同時(shí)，有研究提示在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)大鼠

6、正常腎成纖維細(xì)胞(NRK-49F)細(xì)胞纖維化過程中miR-29c表達(dá)下調(diào)，而miR-29c的表達(dá)增強(qiáng)可有效抑制TGF-β1刺激NRK-49F細(xì)胞株ColⅠ的表達(dá)，表明miR-29c是抑制纖維化的基因。在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生時(shí)或發(fā)生前，維持細(xì)胞的miR-29c的高表達(dá)可抑制或延緩纖維化進(jìn)展。因此，miR-29c與RNS的腎間質(zhì)纖維化的相關(guān)性尤為重要。miRNA既往的研究表明，miR-29c，miR-192在腎病外周血及組織中有不同表達(dá)，在尿沉

7、淀中可以量化，根據(jù)不同病理類型尿miRNA水平不同，所以對miRNA的研究可以協(xié)助RNS做病理類型的評估，臨床治療的指導(dǎo)，預(yù)后的判定等等。
　　 目前西藥治療RNS主要是激素、免疫抑制劑和細(xì)胞毒類藥物，但副作用大，臨床應(yīng)用受限。因此，發(fā)揮中醫(yī)藥特色和優(yōu)勢，探求臨床方便有效的中醫(yī)藥治療RNS有著重要的意義。
　　 RNS屬于中醫(yī)的“水腫”、“腰痛”、“虛勞”、“尿濁”等范疇?！八[”與RNS最相符。氣虛血瘀是RNS發(fā)病的基

8、礎(chǔ)，濕熱蘊(yùn)結(jié)是發(fā)展過程中的促進(jìn)因素，本虛標(biāo)實(shí)是RNS的病機(jī)特點(diǎn)。所以以益氣健脾益腎、活血化瘀通絡(luò)、清熱利濕消腫等治療為法，芪蛭腎綜顆粒由黃芪、白術(shù)、益母草、水蛭、玉米須、石韋組成。根據(jù)RNS臨床大樣本研究，總結(jié)出最常見證型:氣虛血瘀濕熱型，以此證為法提煉出芪蛭腎綜顆粒，成為南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院和山東省威海市中醫(yī)院的協(xié)定處方。芪蛭腎綜顆粒作為院內(nèi)協(xié)定處方，已經(jīng)應(yīng)用多年，臨床驗(yàn)證表明療效確切，能顯著減少尿蛋白，改善癥狀，減輕高脂高凝狀態(tài)，延

9、緩腎小球硬化進(jìn)展，保護(hù)腎功能。但其治療RNS的作用機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。本課題通過芪蛭腎綜顆粒的治療，檢測臨床癥狀、血生化指標(biāo)、血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、TRX、TXNIP等ROS因子的表達(dá)，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。通過尿miR-29c，miR-192等基因的表達(dá)和病理類型相關(guān)性的研究，為RNS的診療和預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。
　　 第一部分芪蛭腎綜顆粒對RNS患者的治療作用及血清TRX、TXNIP表達(dá)的影響

10、
　　 目的:觀察芪蛭腎綜顆粒對氣虛血瘀濕熱型RNS患者的治療作用，通過檢測RNS患者血清TRX及TXNIP的表達(dá)，分析這兩種氧化應(yīng)激因子與RNS的相關(guān)性，探討其在RNS發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制，從而為RNS的治療提供新的靶點(diǎn)與方向，同時(shí)探討臨床分型、病理分型的療效的關(guān)系，指導(dǎo)臨床治療。
　　 方法:選擇南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腎病中心和威海市中醫(yī)院腎病科2010年12月～2012年12月門診或住院的RNS患者60例，臨床分

11、型:常復(fù)發(fā)22例，激素依賴13例，激素?zé)o效2例，激素部分效應(yīng)23例。其中有46例行腎穿刺活檢術(shù)，病理分型有:局灶節(jié)段性腎小球硬化(Focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)23例，微小病變型(Minimal change nephritis，MCD)2例，系膜增生性腎炎(mesangial proliferative nephritis，MsPGN)18例，膜型腎病(Membranousnephro

12、pathy，MN)3例。隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組（芪蛭腎綜顆粒加基礎(chǔ)治療）30例，對照組（黃葵膠囊加基礎(chǔ)治療）30例，療程3個(gè)月，各組間在年齡、性別、臨床分型、病理分型等方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析臨床類型和病理類型的關(guān)系，及其與療效的關(guān)系，檢測兩組治療前后中醫(yī)證候評分療效、臨床療效、24h尿蛋白定量、血漿白蛋白(Alb)、血肌酐(Scr)、凝血酶原時(shí)間(PT)、部分凝血酶原時(shí)間(APTT)、纖維蛋白原(FIB)、SOD、MDA的變化。采用酶聯(lián)免疫檢測

13、技術(shù)(ELISA)檢測血清TRX及TXNIP的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.病理類型與臨床分型的關(guān)系:各病理類型中的臨床分型比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);臨床分型與病理類型的關(guān)系:FSGS和MsPGN比例較高，與其他類型相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.兩組臨床療效比較:實(shí)驗(yàn)組與對照組比較療效顯著（P＜0.05）。
　　 3.各個(gè)臨床分型療效比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05

14、）。
　　 4.各病理類型療效比較，MsPGN、MCN臨床療效較好，與其他類型相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5.中醫(yī)證候療效:兩組治療前后總中醫(yī)癥候評分比較:兩組治療后與治療前相比中醫(yī)癥候總積分均顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，治療后實(shí)驗(yàn)組在癥狀改善明顯優(yōu)于對照組(P＜0.01)。
　　 6.實(shí)驗(yàn)組治療后24h尿蛋白、Scr、BUN較治療前顯著降低，Alb顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

15、0.01);對照組治療后與治療前比較24h尿蛋白、Alb顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);兩組治療后比較，實(shí)驗(yàn)組在Alb顯著上升，BUN顯著下降，實(shí)驗(yàn)組均優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。
　　 7.實(shí)驗(yàn)組治療后與治療前比較FIB顯著降低，PT、APTT顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，對照組治療后與治療前比較PT、APTT顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);兩組治療后比較，

16、實(shí)驗(yàn)組FIB顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 8.實(shí)驗(yàn)組治療后與治療前比較，SOD顯著升高，MDA顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);兩組治療后比較，實(shí)驗(yàn)組較對照組SOD明顯升高，MDA明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 9.實(shí)驗(yàn)組治療后與治療前比較，TRX顯著升高，TXNIP顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;對照組治療后與治療前比較TRX、TXNIP變化不明顯，差異無

17、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，治療后兩組比較，治療組與對照組相比TRX顯著上升，TXNIP顯著降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.在各臨床分型中FSGS和MsPGN比例較高，在病理類型中MCD、MsPGN療效較高。
　　 2.芪蛭腎綜顆粒治療RNS患者療效評價(jià):能明顯的降尿蛋白，優(yōu)于對照組。
　　 3.臨床分型與療效關(guān)系證實(shí):激素依賴和常復(fù)發(fā)療效稍好，但與激素?zé)o效和部分效應(yīng)

18、的對比無顯著性差異。即臨床分型和療效無明顯相關(guān)性。
　　 4.病理分型與療效關(guān)系證實(shí):治療后MCD、MsPGN治療效果明顯，優(yōu)于與其他病理分型。
　　 5.芪蛭腎綜顆粒在中醫(yī)癥候療效比較，實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對照組;治療后中醫(yī)癥候總積分明顯下降，實(shí)驗(yàn)組優(yōu)于對照組。即芪蛭腎綜顆粒在中醫(yī)癥候改善優(yōu)勢明顯。
　　 6.芪蛭腎綜顆粒有更好的升高血漿白蛋白，保護(hù)腎功的作用。
　　 7.芪蛭腎綜顆粒能夠改善RNS患者血液高凝狀

19、態(tài)，升高PT、APTT，在降低FIB上顯著優(yōu)于對照組。
　　 8.芪蛭腎綜顆粒能夠升高RNS患者SOD水平，降低其MDA水平，改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　 9.芪蛭腎綜顆粒能夠升高RNS患者TRX水平，降低TXNIP水平。TRX、TXNIP作為氧化應(yīng)激的相關(guān)因子，在RNS中發(fā)揮作用。
　　 10.芪蛭腎綜顆?？赡芡ㄟ^抗氧化應(yīng)激機(jī)制，在RNS的治療中發(fā)揮著重要的作用。
　　 第二部分尿miRNA-192，2

20、9c的表達(dá)與RNS芪蛭腎綜顆粒的療效和RNS病理關(guān)系的初步研究
　　 目的:通過檢測尿miR-192、miR-29c在RNS不同病理類型的患者和健康對照者尿中的表達(dá)，探討尿miR-192、miR-29c作為RNS辨別腎組織學(xué)病變和反映疾病嚴(yán)重程度的可靠的非侵入性的生物標(biāo)記物的可能性。檢測芪蛭腎綜顆粒治療前后尿miR-192和miR-29c的表達(dá)，研究與24h尿蛋白、Alb、TC、脂蛋白a(Lp-a)等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　

21、　 方法:選擇南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腎病中心和威海市中醫(yī)院腎病科2010年12月～2012年12月門診或住院的經(jīng)腎活檢確診的44例RNS患者，其中包括18例MsPGN，3例MN和23例FSGS，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組（芪蛭腎綜顆粒加基礎(chǔ)治療）23例，對照組（黃葵膠囊加基礎(chǔ)治療）21例，療程3個(gè)月，各組間在年齡、性別、病理分型等方面無差異。設(shè)立健康對照組15人，為威海市中醫(yī)院腎病科醫(yī)護(hù)人員中的健康志愿者。RNS患者取治療前

22、和治療3個(gè)月后的清晨空腹尿液標(biāo)本100ml和血標(biāo)本，健康人清晨空腹收集尿液標(biāo)本100ml，尿標(biāo)本先在3000rmp離心30分鐘后，再在13000rmp離心5分鐘，丟棄上清液，將尿沉渣分裝于1.5ml EP管中，每管0.25ml。每只EP管中加入0.75ml Trizol LS，劇烈震蕩1min充分裂解，室溫靜置5min后-80℃冰箱保存待用。Trizol提取總RNA，進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測合格后，即可構(gòu)建miR-192、miR-29c的RT

23、-PCR反應(yīng)體系，分別檢測各樣本miR-192、miR-29c的相對表達(dá)量并做統(tǒng)計(jì)分析。治療前后檢測24小時(shí)尿蛋白，血標(biāo)本用生化儀做治療前后TC、Lp-a、Alb等指標(biāo)的檢測，測試尿miR-192、miR-29c與RNS患者癥狀指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1與健康對照組比較，miR-29c在FSGS中的表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在MsPGN、MN中的表達(dá)下降不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.

24、05)。miR-192在MsPGN表達(dá)明顯上升(P＜0.05)，在FSGS、MN中的表達(dá)上升不明顯(P＞0.05)。
　　 2.尿miR-29c表達(dá)與Lp-a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Alb表達(dá)呈正相關(guān)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。尿miR-192表達(dá)與24h尿蛋白和TC表達(dá)正相關(guān)，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。
　　 3.實(shí)驗(yàn)組治療后與治療前比較尿miR-29c顯著升高，miR-192表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

25、義(P＜0.01);對照組治療前后比較，尿miR-29c顯著升高，miR-192表達(dá)顯著降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05）;治療后實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，治療組miR-29c顯著升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意（P＜0.05）;
　　 結(jié)論:
　　 1.尿miR-192表達(dá)在MsPGN患者中顯著升高;
　　 2.MsPGN患者可能存在較多的ECM分泌和沉積，可以判斷腎小球ECM的程度。指導(dǎo)臨床治療和預(yù)后的判斷;
　　 3.尿

26、miR-29c表達(dá)在FSGS患者顯著降低;
　　 4.FSGS患者可能存在腎間質(zhì)纖維化明顯，可以判斷腎間質(zhì)纖維化的程度，上調(diào)尿miR-29c水平可能有助于腎纖維化的治療;
　　 5.尿miR-192，29c的差異表達(dá)顯示了RNS各病理類型之間的差異，提供RNS分型的新方法，更好地理解RNS的發(fā)病機(jī)理;
　　 6.尿miR-192，29c的表達(dá)與24h尿蛋白、TC、Lp-a、Alb的相關(guān)性顯示，多方面因素均可加重腎