尿酸減輕6-羥基多巴胺對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用.pdf

1、帕金森病(Parkinsons disease,PD)是中老年人群中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一,具有隱性起病,緩慢進(jìn)展的特征。隨著我國人口老年化進(jìn)程的加快,PD的發(fā)病率日益增高。我國目前大約有200萬PD患者,每年新增PD病人約10萬人。55歲以上人群的患病率為1.07％,75歲以上人群的患病率達(dá)到了2.5％,預(yù)計(jì)到2030年我國PD患者人數(shù)將近500萬。
　　 PD的主要病理特征為中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性變性

2、、減少,其發(fā)生機(jī)制與氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),線粒體功能障礙密切相關(guān)。當(dāng)臨床出現(xiàn)PD運(yùn)動(dòng)障礙癥狀時(shí),黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的數(shù)目已經(jīng)減少50％以上,紋狀體DA含量的減少已達(dá)80％以上。由于目前尚無根本性的治療方法,因此及早開展神經(jīng)保護(hù)治療,具有重要的臨床意義。
　　 尿酸(uric acid,UA)是體內(nèi)腺苷、鳥苷和飲食中細(xì)胞內(nèi)核糖核酸嘌呤代謝的終末產(chǎn)物,兩者分別占到體內(nèi)尿酸總量的80％和20％,它是一種天然的抗氧

3、化劑,清除人體中達(dá)60％的自由基。尿酸能清除O2-、OH和單態(tài)氧、阻止SOD的降解。SOD阻止NO與O2-反應(yīng)生成過氧化亞硝酸鹽。尿酸能有效阻止蛋白的硝基化,能螯合鐵離子并且抑制鐵依賴的抗壞血酸的氧化所導(dǎo)致的氧化損傷。另外,尿酸不僅僅是和氧自由基結(jié)合,而且還通過星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的機(jī)制來保護(hù)神經(jīng)元。近年來的流行病學(xué)及臨床研究發(fā)現(xiàn)PD發(fā)病及進(jìn)展快慢與尿酸的關(guān)系密切相關(guān)。
　　 PC12細(xì)胞株源于大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,胞質(zhì)富含多巴胺受

4、體及合成、分解多巴胺所需的各種酶,生理及生化功能等方面接近于多巴胺神經(jīng)元。6-OHDA是多巴胺類似物,其結(jié)構(gòu)與多巴胺相類似,常被誤作為DA神經(jīng)遞質(zhì)攝入DA能神經(jīng)元,選擇性地破壞DA能神經(jīng)元,造成DA能神經(jīng)元死亡,在PD病人腦內(nèi)和尿樣中檢測到6-OHDA。6-OHDA作為多巴胺神經(jīng)元的選擇性毒素,常被應(yīng)用于制作帕金森動(dòng)物和細(xì)胞模型。本實(shí)驗(yàn)就尿酸是否對(duì)6-OHDA造成的PC12細(xì)胞損害具有保護(hù)作用進(jìn)行研究。
　　 第一部分：

5、　　 目的:評(píng)價(jià)尿酸(uric acid UA)和6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響。
　　 方法:PC12細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),2～3天換液。待細(xì)胞增長至80％融合時(shí),用0.25％胰酶消化細(xì)胞,加含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹打成為單細(xì)胞懸液,1:4比例傳代分瓶。采用MTT分別法檢測不同劑量的UA、6-OHDA對(duì)細(xì)胞活性的影響。分組:6-OHDA分為對(duì)照組(DMEM)、25、50、75、100、125μ

6、mol/L作用24小時(shí)對(duì)細(xì)胞活性的影響。尿酸組分為:對(duì)照組(DMEM)、100、200、300、400、500μmol/L尿酸組。
　　 結(jié)果:6-OHDA能降低PC12細(xì)胞的生存率,25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100、125μmol/L6-OHDA作用24小時(shí)細(xì)胞生存率分別為93.3±6.0％、79.86±5.20％、55.92±3.72％、47.05±2.06％、46.56±3.43％；100～50

7、0μmol/L尿酸作用PC12細(xì)胞24小時(shí),PC12細(xì)胞生存率分別為93.3±6.0％、98.9±6.8％、105.0±4.0％、106.6±5.0％,131.5±16.4％,其中100～400μmol/L的尿酸和對(duì)照組100±3.7％相比較,無顯著性差異(P>0.05),對(duì)PC12細(xì)胞生存率沒有明顯影響,而500μmol/L尿酸組PC12細(xì)胞生存率與對(duì)照組相比較顯著提高(P<0.01)。
　　 結(jié)論:6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞

8、具有毒性作用,濃度越高,毒性作用越強(qiáng)；一定濃度范圍的尿酸對(duì)PC12細(xì)胞的生長沒有影響。
　　 第二部分：
　　 目的:評(píng)價(jià)尿酸減輕6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞的毒性作用。
　　 方法:PC12細(xì)胞用含10％小牛血清的DMEM進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng),2～3天換液。待細(xì)胞增長至80％融合時(shí),用0.25％胰酶消化細(xì)胞,加含血清的培養(yǎng)基終止消化,吹打成為單細(xì)胞懸液,1:4比例傳代分瓶。采用MTT法檢測50μmol/L6-OHDA作用

9、6h、12h、24h對(duì)細(xì)胞的毒性作用,相同條件下同時(shí)檢測尿酸的細(xì)胞保護(hù)作用。MTT法檢測,分組為:對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)、6-OHDA(50μmol/L)組和尿酸(100μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)、尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)、尿酸(300μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)、尿酸(400μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)。
　　 Caspase-

10、3免疫熒光染色法檢測PC12細(xì)胞caspase-3活性,選取其中一個(gè)保護(hù)作用明顯,單獨(dú)對(duì)PC12細(xì)胞生存率沒有影響的尿酸濃度(200μmol/L),觀察藥物作用24小時(shí)其對(duì)6-OHDA造成的caspase-3活性影響,分為正常對(duì)照組(DMEM培養(yǎng)基)、6-OHDA(50μmol/L)組,尿酸(200μmol/L)組和尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)組。Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率,分組同cas

11、pase-3免疫熒光染色。
　　 結(jié)果:50μmol/L6-OHDA作用6、12、24h,PC12細(xì)胞生存率進(jìn)行性下降:95.5±2.4％,88.7±5.1％,73.8±10.0％。其中12、24h細(xì)胞生存率顯著下降(P<0.01)；尿酸(100～400μmol/L)對(duì)50μmol/L6-OHDA作用6、12、24h造成的PC12細(xì)胞生存率下降有顯著的提高(P<0.01)。
　　 Caspase-3免疫熒光染色檢測PC1

12、2細(xì)胞內(nèi)caspase-3的活性結(jié)果顯示對(duì)照組和200μmol/L尿酸組可見弱的紅色熒光,50μmol.L6.OHDA組可見強(qiáng)烈的紅色熒光,尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)較50μmol/L6-OHDA組紅色熒光減弱。
　　 Armexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率尿酸單獨(dú)作用于PC12細(xì)胞24小時(shí)的凋亡率3.2±0.8％和對(duì)照組3.5±1.3％沒有差別(P>0.05),加入50μmol/L6-O

13、HDA作用24小時(shí)后,細(xì)胞的凋亡率9.8±2.3％和對(duì)照組相比顯著增高(P<0.05),而尿酸(200μmol/L)+6-OHDA(50μmol/L)組的細(xì)胞凋亡率(6.0±1.5％)和6-OHDA(9.8±2.3％)組比較,凋亡率顯著降低(P<0.05)
　　 結(jié)論:尿酸能夠明顯減輕6-OHDA對(duì)PC12細(xì)胞的損傷,減少6-OHDA所致的caspase-3的激活,減少6-OHDA導(dǎo)致的凋亡。
　　 結(jié)論：