35﹪氧預處理對低氧誘發(fā)PC12細胞死亡的保護作用.pdf

1、活性氧包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH)和其它氧化物，過去認為是有細胞毒性的，能夠損害脂質(zhì)、蛋白和DNA。除外這些有害作用外，相當多的證據(jù)表明許多刺激因素能夠刺激產(chǎn)生小量活性氧，該活性氧可作為對這些刺激反應的第二信使。 以前認為缺血預處理(IPC)能夠保護組織免受損傷。缺血預處理已經(jīng)作為生物界的一個普遍的細胞保護機制。現(xiàn)在預處理的概念已經(jīng)擴展到非缺血性應急反應，如活性氧預處理。 許多刺激可導

2、致活性氧的產(chǎn)生，從而上調(diào)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)的活性。而且，ERK可以通過激活一系列轉(zhuǎn)錄因子而促進B細胞淋巴瘤白血病2(Bcl-2)基因的表達。Bcl-2蛋白家族在調(diào)節(jié)程序性死亡過程中發(fā)揮重要的作用。 本文旨在研究35％氧氣預處理3小時是否能夠保護1％氧氣誘導的PC12毒性，35％氧氣預處理誘導的細胞保護作用是否和活性氧產(chǎn)生，細胞外信號激酶途徑及Bcl-2過表達有關。 方法： PC12細胞培養(yǎng)液為DMEM

3、液。PC12細胞先用35％O2預處理180min，然后恢復12小時，最后1％O2低氧暴露72小時。在35％O2預處理前培養(yǎng)液換為無血清培養(yǎng)液。相應藥物加入時間為35％O2預處理前60min。細胞活力用MTT法測定。細胞內(nèi)ROS檢測采用對過氧化物敏感的熒光探針DCFH-DA和HEt。PC12細胞用脂質(zhì)體2000和SiRNA按說明書操作轉(zhuǎn)染。ERKmRNA分析采用RT-PCR法。ERK、Bcl-2表達采用Western Blot。

4、結(jié)果： 1.35％O2預處理對低氧誘導的PC12細胞的影響1％氧氣能導致相當數(shù)量的PC12死亡。但該細胞毒性作用能被35％O2預處理3小時恢復12小時逆轉(zhuǎn)(P<0.01)，而隨后的0、24小時恢復無此作用。 2.ROS產(chǎn)生PC12在35％O2和pyrogallol組相比21％O2組能夠產(chǎn)生更多O2.-，而tempol組產(chǎn)生的O2.-明顯少于35％O2組。35％O2預處理產(chǎn)生的H2O2相比21％O2預處理組無明顯增多。細胞

5、活力在pyrogallol和35％O2組明顯增強，而在tempol組明顯減弱。 3.ERK表達35％O2預處理可以明顯增強細胞活力和磷酸化的ERK1/2表達，這些效應可被ERK信號通路阻止劑PD98059而非PKA/PKC和PI3k/Akt通路阻止劑H7和wortmannin明顯減弱。 35％O2誘導的磷酸化ERK1/2的過表達可被4-羥-tempol明顯減弱。用21％O2和20μMpyrogallol預處理同樣能夠誘導

6、磷酸化ERK1/2的大量表達。而35％O2和過氧化氫酶預處理組和35％O2預處理組，以及21％O2和30μM H2O2預處理組和21％O2預處理組磷酸化的ERK1/2表達無明顯區(qū)別。 4.ERK SiRNA誘導的PC12細胞效應RT-PCR顯示RNA干擾后ERKmRNA表達明顯減少。Western blot分析顯示SP組相比NP組總的和磷酸化的ERK1/2蛋白表達量明顯受到抑制。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染SiRNA的PC12細胞相比正常細胞活

7、力明顯減弱。 5.Bcl-2表達Bcl-2蛋白和磷酸化的ERK蛋白在35％O2預處理組相比其它組表達明顯增加，而在PD組和SiRNA組相比35％O2預處理組和21％O2預處理組表達明顯下降。 結(jié)論： 1.35％O2預處理3小時恢復12小時能夠保護低氧誘導的PC12細胞毒性。 2.35％O2預處理的PC12能夠產(chǎn)生O2-，而O2-在抵抗低氧誘導的PC12細胞毒力方面發(fā)揮關鍵作用。 3.35％O2預處