RNA干擾抑制Nogo-A基因表達對PC12細胞多巴胺釋放及細胞凋亡的影響.pdf

1、第一部分 Nogo-A短發(fā)夾樣RNA真核表達載體的構建
　　 目的：構建靶向Nogo-A基因的短發(fā)夾樣RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表達載體。
　　 方法：根據(jù)Gene bank中提供的Nogo-A基因核苷酸序列，設計并化學合成2條shRNA，退火后克隆到pGenesil-1質(zhì)粒的U6啟動子下游從而構建重組載體，行限制性內(nèi)切酶酶切和基因測序進行鑒定。
　　 結果：序列分析結果表明，兩

2、個重組質(zhì)粒的shRNA編碼序列均成功插入到預定位置。
　　 結論：成功構建靶向Nogo-A的shRNA真核表達載體，為進一步研究Nogo-A蛋白的功能及軸突再生抑制的基因治療提供了新的方法。
　　 第二部分短發(fā)夾樣RNA抑制PC12細胞Nogo-A基因表達的研究
　　 目的：研究Nogo-A shRNA對PC12細胞Nogo-A基因表達的抑制作用，為下一步探索Nogo-A的功能奠定基礎。
　　 方法：經(jīng)脂

3、質(zhì)體2000將前期構建的兩個pGenesil-1/Nogo-A shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細胞，通過熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察EGFP的表達，分別于轉(zhuǎn)染后48h后應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及Western blot法檢測Nogo-A Mrna及蛋白表達水平。
　　 結果：與對照組相比，空載體組的Nogo-A Mrna及蛋白表達水平無顯著性差異(p>0.05)，而轉(zhuǎn)染pGenesil-1-/Nogo-A組的Nogo-A

4、 Mrna及蛋白表達水平均明顯下降(p<0.05)。
　　 結論：構建的pGenesil-1-/Nogo-A shRNA重組質(zhì)粒能有效抑制Nogo-A基因在PC12細胞的表達。
　　 第三部分 RNA干擾抑制Nogo-A基因表達對PC12細胞多巴胺釋放的影響
　　 目的：研究抑制Nogo-A基因表達對PC12細胞多巴胺釋放的影響，探討Nogo-A在神經(jīng)內(nèi)分泌細胞表達的意義。
　　 方法：經(jīng)脂質(zhì)體將Nogo

5、-A shRNA真核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到PC12細胞，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h采用高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測不同處理組細胞的多巴胺釋放量。
　　 結果：與對照組相比，轉(zhuǎn)染48h后Nogo-A shRNA組細胞多巴胺釋放量明顯減少(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染空載體組多巴胺釋放量無明顯變化(P>0.05)。
　　 結論：Nogo-A基因沉默可以抑制PC

6、12細胞多巴胺的釋放，Nogo-A可能參與多巴胺的釋放調(diào)節(jié)。
　　 第四部分 RNA干擾抑制Nogo-A基因表達對PC12細胞凋亡的影響
　　 目的：研究Nogo-A基因沉默對PC12細胞凋亡的影響。
　　 方法：應用脂質(zhì)體將Nogo-A shRNA真核表達載體轉(zhuǎn)染到PC12細胞，在轉(zhuǎn)染后不同時間應用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞增殖活性，原位末端標記(TUNEL)法及流式細胞儀檢測細胞凋亡率。