NF-κB與鉛致PC12細胞毒性作用關系的研究.pdf

1、鉛是一種廣泛存在于環(huán)境，嚴重危害人類健康的重金屬元素。在工業(yè)化迅猛發(fā)展的今天，在我們的日常生活中鉛可謂無處不在，溶混在大氣、土壤、塵埃、水、日用品、裝飾材料、玩具、學習用品中，甚至在食品、中藥材中也有它們的身影。鉛對神經、造血、消化、泌尿、生殖和發(fā)育、心血管、內分泌、免疫、骨骼等各類器官均有不良影響。低水平鉛暴露(≤100g/L)即能干擾血紅素的合成，引起腸道鐵離子吸收障礙，產生缺鐵性貧血。更為嚴重的是它影響嬰幼兒和兒童發(fā)育的中樞神經系

2、統(tǒng)，從而造成智力、記憶力、神經行為的障礙。鉛容易通過胎盤和血腦屏障，胎兒腦對血鉛易感。鉛可通過臍帶或母乳垂直傳播。研究發(fā)現，鉛可直接作用于人體的海馬和大腦皮層，導致認知缺陷和智力下降。慢性低水平的鉛暴露不但影響兒童的智力發(fā)育，還影響學習行為和聽覺等多方面的神經系統(tǒng)發(fā)育過程，其影響是長遠和嚴重的。
　　 有關鉛的神經毒性作用的研究很多，但至今對其神經毒作用的分子機制仍不清楚。已有研究表明，NF-κB在胞內信號轉導過程和基因表達調控

3、中具有重要的作用，而目前有關鉛對中樞神經系統(tǒng)NF-κB信號轉導通路影響的研究未見報道。
　　 本實驗擬從分子水平上探討NF-κB信號轉導通路與鉛的神經毒作用的關系。研究PC12細胞在低劑量鉛暴露情況下，其核轉錄因子NF-κB、p53基因及Bcl-2基因的變化，并探討這種變化與鉛的神經毒性的內在聯系。本研究分兩部分，研究內容及結果如下：
　　 第一部分：醋酸鉛對PC12細胞NF-κB轉錄活性影響研究
　　 目的：探

4、討醋酸鉛及NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)對核轉錄因子-kappa B(NF-κ B)轉錄活性的影響。
　　 方法：將大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞(PC12細胞)暴露于不同濃度的醋酸鉛0 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L、1600 μmol/L，采用四唑鹽比色實驗(MTT）檢測IC50值。

5、用脂質體將pNF-κ B-Luc報告基因質粒轉染入PC12細胞，轉染后的PC12細胞分別暴露于不同濃度的醋酸鉛(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)及不同濃度醋酸鉛加PDTC100 μmol/L，24小時后采用螢光素酶(Luciferase)檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。
　　 結果：用不同濃度的醋酸鉛處理細胞24小時，其生長增殖受到不同程度的抑制，且呈現出劑量反應關系，其IC50值為(533.966

6、±100.830)μmol/L。用不同濃度的醋酸鉛處理轉染后的PC12細胞24小時，結果顯示：PDTC對照組螢光素酶活性較空白對照組降低(P<0.01)；鉛處理組螢光素酶活性較空白對照組高(P<0.01)，且具有劑量依賴性；
　　 鉛+PDTC聯合作用組與PDTC對照組相比，PC12細胞內螢光素酶活性增高(P<0.01)；
　　 結論：醋酸鉛可誘導PC12細胞的NF-κB轉錄活性升高。
　　 第二部分：NF-κB

7、，p53及Bcl-2在鉛誘導PC12細胞凋亡中的作用研究
　　 目的：近年來許多研究發(fā)現p53、Bcl-2基因在細胞凋亡的調控過程中起著重要作用。本實驗試圖從基因表達和蛋白質表達水平上進行觀察，從分子水平上探討鉛誘導PC12細胞凋亡的分子機理。
　　 方法：應用逆轉錄-聚合酶鏈反應檢測p53、p65 mRNA的轉錄；用免疫印記的方法檢測鉛對Bcl-2 蛋白的表達；用流式細胞術研究醋酸鉛誘導PC12細胞凋亡情況及其分子機理

8、。
　　 結果：PC12細胞經不同濃度醋酸鉛(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)處理24小時后，用流式細胞儀檢測其凋亡率(n=3)，鉛組凋亡率明顯高于對照組，改變呈劑量依賴性。差異有顯著性(P<0.05)。RT-PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在404bp(β-actin)、493bp(p65)和538bp(p53)處均出現特異性擴增條帶。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)分別對電泳條帶進行密度分析。結