中藥對(duì)侵襲性真菌感染動(dòng)物模型的調(diào)控及血液腫瘤患者真菌感染的DNA檢測(cè).pdf

1、第一部分：侵襲性真菌感染動(dòng)物模型的建立及中藥對(duì)侵襲性真菌感染動(dòng)物模型的調(diào)控目的：深部真菌感染多為條件致病菌感染，在免疫力正常的人群中發(fā)病率并不高。近年來(lái)，由于大劑量的廣譜抗生素、免疫抑制劑和激素的廣泛使用甚至濫用，導(dǎo)致患者體內(nèi)菌群失調(diào)和機(jī)體免疫力下降，深部真菌感染極易發(fā)生。侵襲性真菌感染(IFI)已日益成為導(dǎo)致惡性血液病患者死亡的重要原因之一。目前臨床上抗真菌治療大多依賴西藥，其藥物毒性大、價(jià)格相對(duì)昂貴的缺點(diǎn)是顯而易見的。而國(guó)內(nèi)不乏優(yōu)良

2、的抗真菌中藥，但由于起步較晚，應(yīng)用有限，值得更進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立侵襲性真菌感染的動(dòng)物模型，并應(yīng)用中藥對(duì)其進(jìn)行調(diào)控，來(lái)觀察和探討中藥抗真菌的療效和意義，為抗真菌中藥的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：選取清潔級(jí)雌性SD成年大鼠12只，隨機(jī)分為四組，分別為A組（免疫抑制+接種孢子+中藥治療組）4只，B組（免疫抑制+接種孢子+蒸餾水組）4只，C組（免疫抑制+未接種孢子組）2只，D組（正常對(duì)照組，未免疫抑制+未接種孢子）

3、2只。免疫抑制采用經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法，接種孢子采用鼻腔滴入法，孢子為濃縮的煙曲霉菌孢子懸液(濃度為1*107)，中藥洽療采用灌胃法，從而建立真菌感染動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物定期采血及處死，血液樣本行血清GM檢測(cè)（半乳糖甘露聚糖檢測(cè)），各組動(dòng)物處死后取肺組織行HE染色及PAM染色（過(guò)碘酸六胺銀染色）制片鏡檢以查找真菌孢子或菌絲，部分肺組織行組織培養(yǎng)。
　　 1.GM檢測(cè)結(jié)果：以GM檢測(cè)i值>0.5為陽(yáng)性判斷結(jié)果顯示免疫抑制+接種孢

4、子組(A+B組)GM檢測(cè)陽(yáng)性率可達(dá)81.5％，其中A組檢測(cè)陽(yáng)性率為：75％，B組GM檢測(cè)陽(yáng)性率為86.7％，A、B兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，以GM檢測(cè)i值>0.7為陽(yáng)性判斷結(jié)果顯示：A、B兩組GM檢測(cè)陽(yáng)性率為：44.4％，其中A組檢測(cè)陽(yáng)性率為：8.33％，B組GM檢測(cè)陽(yáng)性率為73.3％，A組與B組陽(yáng)性率比較差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。C組均為陰性，D組除一個(gè)樣本陽(yáng)性外余皆為陰性，考慮為污染造成的假陽(yáng)性。A組G

5、M檢測(cè)值明顯低于B組，因樣本量較小，結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯。
　　 2.動(dòng)物模型肺組織病理學(xué)檢查：免疫抑制+接種孢子組（A+B組）：共8只大鼠，均可見不同程度的肺組織實(shí)變及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，其中2只大鼠于接種后第7天行肺組織鏡檢在組織中發(fā)現(xiàn)曲霉菌菌絲，C組僅為免疫抑制組，肺組織切片染色后鏡檢可見肺組織炎性病理改變。D組為正常對(duì)照組，肺組織切片染色后鏡檢未發(fā)現(xiàn)明顯異常改變。
　　 3.肺組織培養(yǎng)：各組動(dòng)物肺組織勻漿培養(yǎng)7天均未

6、發(fā)現(xiàn)曲霉菌生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：1.該中藥方劑對(duì)大鼠真菌感染有一定治療作用。2.GM檢測(cè)可先于組織出現(xiàn)病灶之前發(fā)現(xiàn)真菌感染，可用于侵襲性真菌感染的早期診斷。
　　 第二部分：血液腫瘤患者真菌感染的DNA檢測(cè)目的：
　　 1.用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)血液科發(fā)熱病人血清中的曲霉菌DNA含量，并與GM試驗(yàn)和臨床表現(xiàn)相對(duì)比，探索其一致性和準(zhǔn)確性。
　　 2.評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)侵襲性真菌感染的早期診斷價(jià)值。

7、>　　 方法：選取2008-2010年在山東省立醫(yī)院血液科住院的發(fā)熱病人的血清，行GM檢測(cè)，檢測(cè)陽(yáng)性者利用Qiamp DNA MiNi Kit試劑盒提取病人血清樣本中的曲霉菌DNA，選取曲霉菌特異性引物，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法，設(shè)立陰性對(duì)照及標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立SYBR Green法Real-Time PCR的實(shí)驗(yàn)室方法來(lái)定量檢測(cè)臨床發(fā)熱病人的曲霉菌感染，并與GM檢測(cè)方法作對(duì)比，探索其一致性和準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果：利用Qiamp

8、DNA MiNi Kit試劑盒所提取的曲霉菌DNA濃度和純度經(jīng)儀器測(cè)試后基本符合Real-Time PCR的實(shí)驗(yàn)要求，建立的實(shí)時(shí)熒光PCR方法擴(kuò)增曲線及熔解曲線形態(tài)不甚滿意，有大量非特異性擴(kuò)增，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.97(＜0.99)，未能形成有效的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，樣品均無(wú)特異性擴(kuò)增條帶，所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物大小>500Bp，所有樣品均出現(xiàn)引物二聚體的擴(kuò)增條帶，大小