侵襲性真菌感染的快速分子診斷.pdf

1、近三十年來，隨著器官移植、腫瘤化療、免疫抑制劑使用、創(chuàng)傷性醫(yī)療操作等的不斷增多，侵襲性真菌感染(invasive furigal infection，IFI)的發(fā)病率和病死率顯著上升，尤其對(duì)免疫功能低下患者的健康構(gòu)成了重大威脅。早期明確診斷是指導(dǎo)抗真菌治療，降低病死率的關(guān)鍵，但I(xiàn)FI診斷非常困難，臨床常用的影像學(xué)檢查缺乏特異性變化，組織病理活檢和培養(yǎng)受諸多限制，血清抗原/抗體檢測(cè)則受到多種因素影響，假陽(yáng)性、假陰性率較高。臨床上確診IFI

2、主要通過無菌體液或活檢組織的病原體培養(yǎng)，進(jìn)而通過表型鑒定獲取病原學(xué)依據(jù)，但這種方法耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)專業(yè)技術(shù)要求高，結(jié)果的判斷帶有一定的主觀性，已逐漸不能滿足臨床診斷的需要。分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步為IFI的診斷提供了新的思路，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)及表型鑒定相比，分子診斷技術(shù)大大縮短了診斷所需時(shí)間，同時(shí)提高了敏感性和特異性，且操作簡(jiǎn)便、易于重復(fù)。分子診斷方法大多在培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行病原真菌分子鑒定，也有報(bào)道某些分子生物學(xué)技術(shù)可直接從液體培養(yǎng)瓶，甚至臨床樣本中

3、進(jìn)行病原檢測(cè)。
　　 第一部分臨床常見致病性真菌的表型鑒定及分子鑒定
　　 目的:評(píng)價(jià)表型鑒定和分子鑒定一主要是核糖體RNA基因(rDNA)測(cè)序，在臨床常見致病性真菌的鑒定方面各自的特點(diǎn)。
　　 方法:對(duì)55株臨床常見致病性酵母類真菌、絲狀真菌和無綠藻，包括8株標(biāo)準(zhǔn)菌株和47株臨床/環(huán)境分離株進(jìn)行表型鑒定和rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1、2(interrlal transcribed spacer1 and2，ITS1

4、and ITS2)以及28s5’端D1/D2區(qū)序列測(cè)定。以表型鑒定聯(lián)合rDNA測(cè)序結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算單個(gè)片段、多個(gè)片段：rDNA測(cè)序及表型鑒定各自的準(zhǔn)確率。
　　 結(jié)果:表型鑒定將67.7％(21/31)的酵母類真菌和45.5％(10/22)的絲狀真菌正確鑒定至種；rDNA測(cè)序的鑒定準(zhǔn)確性高于表型鑒定，對(duì)酵母類真菌，D1/D2片段測(cè)序鑒定的準(zhǔn)確率高于ITS1片段(83.9％VS.61.3％)和ITS2片段(83.9％VS.77.

5、4％)；對(duì)絲狀真菌，ITS1片段(68.2％VS.59.1％)和ITS2片段(63.6％VS.59.1％)測(cè)序的鑒定準(zhǔn)確率均高于D1/D2片段測(cè)序；多個(gè)片段聯(lián)合測(cè)序鑒定效果優(yōu)于單個(gè)片段測(cè)序；rDNA測(cè)序法對(duì)某些進(jìn)化關(guān)系非常相近的同一菌屬中的菌株無法鑒定至種；聯(lián)合表型鑒定和rDNA測(cè)序，本研究中所有待測(cè)菌株90.9％(50/55)鑒定至種，100％鑒定至屬。
　　 結(jié)論:表型鑒定目前在臨床IFI病原診斷上仍不可取代，尤其對(duì)于基因型

6、非常相似的菌株鑒定；rDNA測(cè)序鑒定準(zhǔn)確性高于表型鑒定，且不同的靶序列對(duì)于不同菌種鑒定價(jià)值不同，聯(lián)合多個(gè)位點(diǎn)測(cè)序鑒定準(zhǔn)確性高于單個(gè)位點(diǎn)測(cè)序；rDNA測(cè)序目前仍依賴于菌株培養(yǎng)，不能鑒定同時(shí)存在的病原體，對(duì)于直接從臨床樣本中檢測(cè)病原體受到很多限制；表型鑒定聯(lián)合rDNA測(cè)序可將絕大多數(shù)臨床常見致病性真菌準(zhǔn)確鑒定至種，可作為評(píng)價(jià)其他鑒定/診斷方法的標(biāo)準(zhǔn)。
　　 第二部分微流芯片一分子指紋法鑒定臨床常見致病性真菌
　　 目的:構(gòu)建

7、致病性真菌微流芯片一分子指紋鑒定法，并評(píng)估其對(duì)臨床常見致病性真菌的鑒定作用。
　　 方法:以臨床常見的歸屬于10個(gè)菌屬的22個(gè)菌種(包括10種酵母菌菌種和11種絲狀真菌菌種)的真菌菌株為研究對(duì)象，對(duì)表型鑒定聯(lián)合rDNA測(cè)序確定至種的菌株進(jìn)行分子指紋PCR擴(kuò)增，并以微流芯片技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，建立常見致病性真菌不同菌種的M13和(GACA)4單引物微流芯片-分子指紋庫(kù)。計(jì)算相似性系數(shù)以分析兩種微流芯片-分子指紋的種間相似性和種內(nèi)相似

8、性，并抽取不同的菌株為研究對(duì)象來驗(yàn)證上述致病性真菌微流芯片-分子指紋鑒定系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建了M13和(GACA)4致病性真菌微流芯片-分子指紋庫(kù)用于菌株鑒定，相似性的分析結(jié)果顯示，所有菌種M13和(GACA)4微流芯片-分子指紋種間相似性系數(shù)平均值分別為26.7％和26.1％，酵母類真菌和絲狀真菌分別單獨(dú)比對(duì)時(shí)，僅M13分子指紋中的光滑念珠菌-膠紅酵母，和(GACA)4分子指紋中的馬爾尼菲青霉-尖孢鐮刀菌種間相

9、似性較高(70％≤值<100％)。應(yīng)用于不同真菌菌株的鑒定結(jié)果顯示，當(dāng)酵母類真菌和絲狀真菌分別單獨(dú)比對(duì)時(shí)，M13和(GACA)4致病性真菌微流芯片-分子指紋可分別將95.5％和96.4％的菌株正確鑒定至種；相似性系數(shù)(S值)≥50％的菌株之間有可能混淆；模板DNA的質(zhì)量和濃度差異及不同擴(kuò)增條件造成的片段大小和數(shù)量差異均有可能影響鑒定結(jié)果。
　　 結(jié)論:微流芯片技術(shù)用于分子指紋的檢測(cè)大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，更加便于構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)及進(jìn)行客觀

10、的條帶比對(duì)；微流芯片-分子指紋法用于臨床常見的致病性真菌菌株鑒定具有快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化的顯著優(yōu)點(diǎn)，尚需對(duì)操作流程進(jìn)行規(guī)范化及構(gòu)建更加全面的數(shù)據(jù)庫(kù)；除應(yīng)用于菌株鑒定外，該方法還可應(yīng)用于菌種的基因分型、分子流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域。微流芯片-分子指紋法目前尚不具備直接從臨床樣本中檢測(cè)真菌病原體的條件。
　　 第三部分多位點(diǎn)PCR-電噴射電離質(zhì)譜技術(shù)鑒定臨床常見致病性真菌
　　 目的:評(píng)價(jià)PCR-電噴射電離質(zhì)譜技術(shù)(PCR coup

11、led with electrosprayionization mass spectrometry，PCR/ESI-MS)對(duì)臨床常見的致病性真菌，包括酵母類真菌和絲狀真菌的鑒定效果，及在臨床診斷中的應(yīng)用前景。
　　 方法:對(duì)55株經(jīng)表型鑒定聯(lián)合rDNA測(cè)序鑒定至種或?qū)俚恼婢≡w，包括8株標(biāo)準(zhǔn)菌株和47株臨床/環(huán)境分離株進(jìn)行PCR/ESI-MS鑒定，所有待測(cè)樣本分為兩組：PCR/ESI-MS廣譜真菌鑒定系統(tǒng)(PLEX-ID檢測(cè)平

12、臺(tái))可檢測(cè)范圍內(nèi)組(共47株菌株)和PCR/ESI-MS廣譜真菌鑒定系統(tǒng)可檢測(cè)范圍外組(共8株菌株)。分別評(píng)價(jià)PCR/ESI-MS對(duì)兩組菌株的鑒定準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)果:對(duì)于廣譜真菌鑒定系統(tǒng)可檢測(cè)范圍內(nèi)的菌株，85.1％(40/47)準(zhǔn)確鑒定至種或種復(fù)合體，87.2％(41/47)準(zhǔn)確鑒定至屬；而系統(tǒng)可檢測(cè)范圍外的菌株，37.5％(3/8)可鑒定至屬。此外，PCR/ESI-MS可檢測(cè)一份樣本中同時(shí)存在的多種病原體DNA。