IDH1基因在人腦膠質(zhì)瘤中突變及其功能意義研究.pdf

1、目的：分析IDH1R132基因突變?cè)谌四X膠質(zhì)瘤中的分布特征。
　　 方法：90例不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤活體標(biāo)本及其血液標(biāo)本，苯酚一氯仿抽提法提取DNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，PCR及直接測(cè)序。
　　 結(jié)果：90例膠質(zhì)瘤標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)42例IDH1基因突變，IDH1基因突變?yōu)镽132H。其中在Ⅱ、Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)突變38例，其突變率高達(dá)55％(突變平均年齡為38.6±2.2歲；非突變平均年齡為47.5±2.9歲)，兩組間年齡比較有顯著性差

2、異。而在Ⅰ級(jí)膠質(zhì)瘤中未發(fā)現(xiàn)；Ⅳ級(jí)膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)突變4例，突變率為21.1％(突變組患者平均年齡41.5±2.3歲，非突變組53.3±3.6歲)，兩組間年齡比較有顯著性差異。而所有患者其相應(yīng)血液標(biāo)本中未發(fā)現(xiàn)該突變。
　　 結(jié)論：在國(guó)內(nèi)率先報(bào)道了IDH1R132基因在中國(guó)人群膠質(zhì)瘤中的突變頻率。并且發(fā)現(xiàn)突變組平均年齡較非突變組小。
　　 目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)IDH1 wild—pCDNA3.1及IDH1 R132H—pCDNA3

3、-1的Hela及U251細(xì)胞株。
　　 方法：將IDH1wild和R132H型分別轉(zhuǎn)染Hela和U251細(xì)胞，然后運(yùn)用RT—PCR、Western—Blotting進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 結(jié)果：獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IDH1wild—pCDNA3.1及IDH1 R132H—pCDNA3.1的Hela及U251細(xì)胞株。
　　 結(jié)論：獲得了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IDH1 wild—pCDNA3.1及IDH1 R132H—pCDNA3.1的Hel

4、a及U251細(xì)胞株。
　　 目的：在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IDH1 wild及R132H的Hela及U251細(xì)胞株中，觀察IDH1R132H對(duì)細(xì)胞功能的影響。
　　 方法：(1)通過(guò)MTT法檢測(cè)比較轉(zhuǎn)染細(xì)胞活性并繪制生長(zhǎng)曲線，并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡的情況；(2)同時(shí)對(duì)IDH1酶活力進(jìn)行檢測(cè)；(3)免疫組化檢測(cè)同級(jí)別膠質(zhì)瘤中突變標(biāo)本和非突變標(biāo)本中HIF-1α及VEGF的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：(1)轉(zhuǎn)染

5、野生型基因的Hela或U251細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度與空轉(zhuǎn)組、未轉(zhuǎn)染、突變轉(zhuǎn)染組相比均顯著降低，突變型與空轉(zhuǎn)組及未轉(zhuǎn)染組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)：空轉(zhuǎn)、野生和突變轉(zhuǎn)染組Hela細(xì)胞處于G1期比例分別為：57.75±4.15％、61.10±3.22％、47.41±2.17％，S期的細(xì)胞比例分別為：30.54±2.11％、29.81±2.92％、38.84±1.92％，G2期的細(xì)胞比例分別：11.70±3.17％、7.21±

6、2.41％、13.74±3.01％。突變轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)G2+S期細(xì)胞比例高于空轉(zhuǎn)和野生轉(zhuǎn)染組，野生轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。U251細(xì)胞空轉(zhuǎn)、野生和突變轉(zhuǎn)染細(xì)胞G2+S比例分別為34.12±3.56％、36.45±4.73％、43.68±3.16％，突變轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均出現(xiàn)G2+S期細(xì)胞比例高于空轉(zhuǎn)和野生轉(zhuǎn)染組，而野生轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(2)轉(zhuǎn)染后，酶的活力測(cè)定結(jié)果表明：與野生轉(zhuǎn)染組相比，Hela突變轉(zhuǎn)染組酶的活力下降了

7、64.09％，空轉(zhuǎn)組下降了72.44％。U251突變轉(zhuǎn)染組酶的活力較野生轉(zhuǎn)染組下降了39.79％，空轉(zhuǎn)組下降了48.9％。野生轉(zhuǎn)染組與突變轉(zhuǎn)染及空轉(zhuǎn)組相比酶活力增加(P<0.05)，空轉(zhuǎn)組及突變轉(zhuǎn)染組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(3)HIF-1α、VEGF陽(yáng)性反應(yīng)物分別定位于細(xì)胞核、胞漿，染色為棕黃色，兩者在突變膠質(zhì)瘤中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于野生組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：在兩種轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株中均發(fā)現(xiàn)IDH1R132H組生長(zhǎng)增殖活躍、而轉(zhuǎn)

8、染野生型后IDH酶活力明顯增強(qiáng)。IDH1基因可能是抑癌基因。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)在同級(jí)別膠質(zhì)瘤突變組中HIF-1α及VEGF表達(dá)高于非突變組。
　　 目的：在轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞株中，檢測(cè)IDH1 R132H突變對(duì)化療藥物敏感性。
　　 方法：觀察不同濃度順鉑對(duì)于U251細(xì)胞株在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制率。從而選擇合適的藥物干預(yù)濃度及時(shí)間點(diǎn)。在轉(zhuǎn)染之野生和突變U251細(xì)胞株分別加入順鉑，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及Western—Blot