fibulin-5基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達、作用及機制研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占顱內(nèi)腫瘤的40％-50％。其呈侵襲性生長，總體療效不佳，尤其是高分級膠質(zhì)瘤，具有高度間變的生長特點，術(shù)后復(fù)發(fā)快、預(yù)后差，嚴重威脅人類健康，是神經(jīng)外科治療中相對棘手的難治性腫瘤之一。增殖的微血管對膠質(zhì)瘤的惡性生物學行為起著重要作用。在膠質(zhì)瘤的分級標準中，將血管的形態(tài)學改變作為惡性指標之一，明顯不同于顱外其他腫瘤，無疑將血管生成在該瘤中的作用上升到一個新的高度。目前抗血管生成作為腫瘤治療的新方法，已

2、迅速發(fā)展為重要的抗癌策略，并成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。在經(jīng)手術(shù)切除、放療和化療等綜合治療仍無法從根本上改善膠質(zhì)瘤預(yù)后的情況下，抗血管生成治療有可能成為改善膠質(zhì)瘤預(yù)后的突破口。 有研究指出fibulin-5可以促進人HT1080纖維肉瘤細胞的DNA合成，并增強其侵襲基底膜的能力；但是在腎癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等惡性腫瘤中，fibulin-5的表達明顯降低。另有實驗發(fā)現(xiàn)fibulin-5能通過抑制腫瘤血管生成來減緩老鼠癌性腫瘤

3、的生長。這些研究顯示fibulin-5的表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和血管生成存在緊密聯(lián)系。但是目前fibulin-5對腫瘤細胞的生物學特性的影響還不甚清楚；在腫瘤血管生成中的具體調(diào)控機制還有待進一步研究；在膠質(zhì)瘤中的表達及作用在國內(nèi)外亦未見到相關(guān)報道。HUVEC-2C是經(jīng)典的血管內(nèi)皮細胞模型，U251是來源于多形性膠質(zhì)母細胞瘤WHO IV級的細胞株。因此在本文中，我們擬首先探討fibulin-5在人腦膠質(zhì)瘤中的表達情況。然后擬通過體外單純血管

4、內(nèi)皮細胞模型(HUVEC-2C)以及Transwell培養(yǎng)技術(shù)構(gòu)建的HUVEC-2C和U251共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤微環(huán)境模型探討fibulin-5與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 第一章 fibulin-5在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達及意義 目的：初步探討fibulin-5在膠質(zhì)瘤中的表達情況及其與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。 方法：通過免疫組織化學方法檢測fibulin-5蛋白、K1-67，F(xiàn)actor VⅢ及HIF-1α蛋白在正

5、常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達情況，并分析fibulin-5蛋白的表達與膠質(zhì)瘤的病理分級、膠質(zhì)瘤Ki-67標記指數(shù)(Ki-67 LI)、微血管密度(MVD)及HIF-1α蛋白表達的關(guān)系。實驗分三組：對照組為正常腦組織(7例)、低分級膠質(zhì)瘤組(21例WHO分類Ⅰ～Ⅱ級的膠質(zhì)瘤石蠟標本)和高分級膠質(zhì)瘤組(19例WHO分類Ⅲ～Ⅳ級的膠質(zhì)瘤石蠟標本)。通過RT-PCR檢測fibulin-5 mRNA在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達情況。實驗分三組

6、：對照組為正常腦組織(7例)、低分級膠質(zhì)瘤組(22例WHO分類Ⅰ～Ⅱ級的新鮮膠質(zhì)瘤標本)和高分級膠質(zhì)瘤組(15例WHO分類Ⅲ～Ⅳ級的新鮮膠質(zhì)瘤標本)。 結(jié)論：fibulin-5在正常腦組織中表達，其在膠質(zhì)瘤組織中表達的變化可能與膠質(zhì)瘤的進展和血管生成存在聯(lián)系。 第二章 目的:構(gòu)建人fibulin-5基因表達的慢病毒質(zhì)粒并感染HUVEC-2C篩選混合穩(wěn)定株，為體外研究fibulin-5的生物學功能提供材料。

7、 方法：通過RT-PCR檢測fibulin-5 mRNA在HUVEC-2C和U251細胞株的表達。通過構(gòu)建含有fibulin-5的重組pGC-FU載體，并用293T細胞包裝病毒，將得到的人fibulin-5基因表達的慢病毒質(zhì)粒感染HUVEC-2C并篩選，最終得到人fibulin-5基因表達的HUVEC-2C混合穩(wěn)定株。 結(jié)果：fibulin-5 mRNA在HUVEC-2C和U251細胞株均不表達。在人fibulin-5基因表達的

8、HUVEC-2C混合穩(wěn)定株中，通過Westem blot和Real-time PCR方法檢測到fibulin-5的表達。 結(jié)論：成功建立了人fibulin-5基因表達的HUVEC-2C混合穩(wěn)定株，為進一步實驗做準備。 第三章 目的：探討人fibulin-5基因表達對內(nèi)皮細胞生物學特性的影響，以明確其在血管生成中的作用及機制。 方法：實驗分3組：CON組(未作任何干擾的HUVEC-2C細胞株)；NC組(陰性

9、對照慢病毒感染HUVEC-2C篩選的混合穩(wěn)定細胞株)；KD組(人fibulin-5基因表達的慢病毒質(zhì)粒感染HUVEC-2C篩選的混合穩(wěn)定細胞株)。通過MTT法、結(jié)晶紫染色法、流式細胞儀分析法和成管能力實驗檢測人fibulin-5基因表達對HUVEC-2C的增殖、粘附、遷移、凋亡和成管能力的影響。 結(jié)果：MTT檢測發(fā)現(xiàn)在相同的時間點，KD組的OD值明顯低于CON組和NC組(P<0.05)；檢測粘附能力試驗中，接種30min后KD組

10、結(jié)晶紫OD值明顯高于CON組和NC組(P<0.05)；檢測遷移能力實驗中，KD組結(jié)晶紫OD值明顯低于CON組和NC組(P<0.05)；培養(yǎng)至第3天進行流式細胞儀檢測可見，KD組HUVEC細胞G0/G1期分布明顯多于NC組和CON組(P<0.05)；S期分布明顯少于NC組和CON組(P<0.05)；G2/M期分布和細胞凋亡率三組無明顯差別(P>0.05)。檢測成管能力實驗中，CON組、NC組及KD組管狀結(jié)構(gòu)相對面積并無明顯差異(P=0.3

11、05)，但是KD組HUVEC-2C成管數(shù)明顯低于CON組和NC組(P<0.05)。在檢測增殖、粘附、遷移、凋亡及成管能力實驗中，CON組和NC組無明顯差異(P>0.05)。 結(jié)論：人fibulin-5基因表達后，可以使內(nèi)皮細胞的細胞周期遲滯；抑制內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和成管能力；可以增強內(nèi)皮細胞的粘附能力。其可能通過減少血管基底膜的溶解、維持細胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性、增強內(nèi)皮細胞的粘附能力來抑制血管新生和維護原有血管的穩(wěn)定。 第

12、四章 目的：探討人fibulin-5基因在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中表達對內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞生物學特性的影響，以明確其在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。 方法：用Transwell技術(shù)體外建立了U251細胞與HUVEC共培養(yǎng)模型。實驗分3組：CON組(其中HUVEC-2C未加任何干擾因素)；NC組(其中HUVEC-2C是陰性對照慢病毒感染HUVEC-2C篩選的混合穩(wěn)定細胞株)；KD組(其中HUVEC-2C是人fibulin-5基因表達的慢

13、病毒質(zhì)粒感染HUVEC-2C篩選的混合穩(wěn)定細胞株)。通過MTT法、結(jié)晶紫染色法和成管能力實驗檢測人fibulin-5基因在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中表達對HUVEC-2C的增殖、粘附、遷移和成管能力的影響。通過MTT法和結(jié)晶紫染色法檢測人fibulin-5基因在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中表達對U251的增殖和遷移能力的影響。 結(jié)果：①在檢測人fibulin-5基因在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中表達對HUVEC-2C生物學功能影響的實驗中發(fā)現(xiàn)：MTT法結(jié)果示在相同的時

14、間點，KD組的OD值明顯低于CON組和NC組(P<0.05)；檢測粘附能力試驗中，接種30min后KD組結(jié)晶紫OD值明顯高于CON組和NC組(P<0.05)；檢測遷移能力實驗中，KD組結(jié)晶紫OD值明顯低于CON組和NC組(P<0.01)；檢測成管能力實驗中，CON組，NC組及KD組管狀結(jié)構(gòu)相對面積并無明顯差異(P=0.996)，但是KD組HUVEC-2C成管數(shù)明顯低于CON組和NC組(P<0.05)，K)組的管型結(jié)構(gòu)更加規(guī)則。在檢測增殖

15、、粘附、遷移及成管能力實驗中，CON組和NC組無明顯差異(P>0.05)。②在檢測人fibulin-5基因在膠質(zhì)瘤微環(huán)境中表達對U251生物學功能影響的實驗中發(fā)現(xiàn)：MTT法結(jié)果示從培養(yǎng)48小時后開始，在相同的時間點，KD組的OD值明顯低于CON組和NC組(P<0.05)，CON組和NC組的OD值無明顯差異(P>0.05)；檢測遷移能力實驗中，CON組、NC組和KD組結(jié)晶紫OD值比較無明顯差異(P＝0.819) 結(jié)論：人fibul